| 研究課題/領域番号 |
23K23306
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02038 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分32010:基礎物理化学関連
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| 研究機関 | 学習院大学 |
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研究代表者 |
岩田 耕一 学習院大学, 理学部, 教授 (90232678)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円)
2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 14,820千円 (直接経費: 11,400千円、間接経費: 3,420千円)
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| キーワード | 生体膜 / ラフト構造 / 時間分解分光法 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
多くの重要な生化学反応の媒体である生体膜は，水中に形成された分子2個分の厚さの薄膜である．生体膜での生化学反応は効率的に進行するが，その機構を化学反応論の視点から説明しようとすると多くの困難に直面する．この問題を解決し得る構造モデルが1990年代から提唱されている「脂質ラフト」である．しかし，実際の細胞膜中での脂質ラフトの存在を示す実験は，知る限りにおいて報告されていない．本研究では，先端的な分光計測法によって生体膜および人工脂質二重膜の基本的な特性を測定して膜の特性を評価する．物理化学の手法を利用して脂質ラフトモデルを検証するとともに，膜構造と機能発現の相関について考察する．
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| 研究実績の概要 |
本研究課題の目的は，先端的分光法を利用して生体膜および人工脂質二重膜の構造と特性を解明することである．生物の生存にとって必要不可欠な生化学反応の多くが進行する脂質二重膜は水中に形成された油の膜であり，その厚さは約5ナノメートルでしかない．化学反応の場としては特異な環境といえる脂質二重膜において膜構成分子がどのように会合しているかを実験的に解明し，構造と機能発現との相関について考察する．
研究の初年度となる令和4年度には，生体膜と人工脂質二重膜の双方の脂質二重膜の粘度を実験によって評価した．溶液中の化学反応においては，溶液の粘度は化学反応の速度に大きな影響を与える．しかし，通常用いられる粘度の測定法では5ナノメートルの厚さしかない脂質二重膜の粘度を測定できない．そのために，けい光寿命が周囲の粘度を反映して変化することが知られているtrans-スチルベンあるいはその類縁化合物の4--[4ジメチルアミノスチリルピリジン（DASP）をプローブ分子として脂質二重膜に埋め込んで，これらの分子のけい光寿命をピコ秒時間分解けい光分光法によって測定した．得られたけい光寿命からプローブ分子近傍の粘度を推定した．
生体膜の試料としては大腸菌外膜を用いた．培養した大腸菌の外膜に埋め込んだプローブ分子のピコ秒時間分解けい光スペクトルを測定した．この実験から，大腸菌外膜は温度上昇とともに柔軟性を失うことが示唆された．人工脂質二重膜の試料としては，大きさが数マイクロメートルのベシクルを用いた．ベシクルを構成する脂質としてDOPC，DMPCおよびDPPCなどを用いた．調製した脂質二重膜ベシクルをスライドガラス上に保持して，ベシクル中の特定の位置からのけい光をピコ秒時間分解測定した．この実験からは，ベシクル脂質二重膜の粘度が時間の経過とともに大きく揺らぐことを示唆する結果を得た．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和4年度には，本研究で利用する自作のピコ秒時間分解けい光顕微分光計の光源として用いるチタンサファイア再生増幅器にシード光を供給するモードロックチタンサファイアレーザーを交換した．さらに，ピコ秒時間分解けい光顕微分光計の検出系を構成するストリークカメラに含まれるCCD検出器とコントローラーを交換する必要も生じた．研究で利用する主要な分光測定装置におけるこれらの修繕が本年度の研究の円滑な遂行に影響を与えたことは否定できない．
一方で，大腸菌外膜や人工脂質二重膜を対象とした時間分解分光計測では，それぞれ重要な結果を得ることができた．大腸菌外膜に埋め込んだtrans-スチルベンのピコ秒時間分解けい光スペクトルは，この膜の粘度が温度上昇とともに増加する可能性が大きいことを示した．これは研究代表者らが事前には予期しなかった結果であり，生体膜の特性との関連を考えると意義深い．人工脂質二重膜に関しては，単一のリン脂質から構成されるベシクル脂質二重膜の粘度が時間によって揺らぐことをベシクル上の特定の位置で持続観測したことは，ピコ秒時間分解けい光顕微分光計の優位性をよく示したといえる．
大腸菌外膜やベシクル人工脂質二重膜の粘度測定以外にも，令和4年度には研究の進展をみた．β-カロテンは高等植物の細胞などに多く含まれる代表的なカロテノイドであるが，サブピコ秒からピコ秒の時間領域で進行するβ-カロテン分子の電子状態緩和の速度定数がリポソーム脂質二重膜中では通常の有機溶媒と比べて減速されることを観測した．この原因は現段階では不明であるが，生体膜中でのカロテノイド分子の光励起状態が有機溶媒中とは異なるとすれば，光合成におけるカロテノイドの役割を議論する際にも考慮すべき事象となるだろう．
以上の状況を総合的に勘案して，現在までの研究は「おおむね順調に進展している」とした．
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度は，令和4年度に得られた結果をもとに本課題の実験研究をさらに進展させる．ピコ秒時間分解けい光分光法を用いて大腸菌外膜およびベシクル人工脂質二重膜の粘度をより多くの条件のもとで測定する．
大腸菌外膜を対象とした実験では，粘度の温度依存性をより詳細に測定する．培養の条件や培養後の生理活性物質の添加など，温度以外の要因が膜の粘度にどのような影響を与えるのかを調べる．ベシクル人工脂質二重膜を対象とした実験では，令和4年度に用いたDASPに加えて新たなプローブ分子も利用することを検討する．この実験に利用するピコ秒時間分解けい光顕微分光計では通常のガラス製対物レンズを用いていたため，ガラスレンズを透過しない紫外光を励起光として使うことができなかった．DASPをプローブ分子として用いたのは，この分子が可視光で光励起されるからであった．しかし，研究代表者らは，令和4年度末に紫外光を集光できる反射鏡を顕微分光計に導入した．令和5年度は，この反射光学系を利用することで，紫外光で励起されるtrans-スチルベン誘導体などのプローブ分子を利用したピコ秒時間分解けい光顕微分光測定を試みる．従来利用してきたDASPの結果と比較検討することで，ベシクル人工脂質二重膜の粘度特性に関するより精密な描像を得る．
令和4年度には，光励起されたβ-カロテンが示す高速の電子状態緩和が有機溶媒中に比べてリポソーム脂質二重膜中では減速することを観測した．令和5年度は，この現象についての実験を進める．リポソームを構成するリン脂質の種類を変化させて，電子緩和の速度に脂質の組成の違いが影響を与えるかどうか調べる．β-カロテン以外のカロテノイド分子でもリポソーム脂質二重膜中で電子状態緩和が変化するか否かを検証する．これらの実験を通じて，生体膜および人工脂質二重膜の構造と特性についての理解をより一層深める．
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