| 研究課題/領域番号 |
23K23459
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02192 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分37010:生体関連化学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
勝山 陽平 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (50646437)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)
2024年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 9,360千円 (直接経費: 7,200千円、間接経費: 2,160千円)
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| キーワード | 生合成 / 放線菌 / 天然物 / 二次代謝 / ジアゾ基 / 亜硝酸 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
放線菌は様々な有用な二次代謝産物を生産する。そこには多様な活性を持つ酵素が用いられている。放線菌の二次代謝産物は様々な特徴的な構造をもち、それらは代謝産物の生理活性に重要である。本研究ではそのような構造の中でも窒素-窒素結合を持つ置換基 (ジアゾ基) とアミノ基を複数持つ芳香環の生合成機構を明らかにすることを目的としている。これらの構造の生合成メカニズムの理解はほとんど進んでいないため、これらの生合成機構の解析により、新規酵素が見出される可能性が高い。また、これらの酵素を改変し利用することで新規医薬品の開発につながる可能性がある。
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| 研究実績の概要 |
Azaserineの生合成機構の解析に関して
Azaserineはヒドラジノ酢酸 (HAA) から生合成される。そこで、HAAがどのような反応を経てazaserineへと変換されるか解析を試みた。まず、HAAから2-hydrazineylideneacetyl基への変換反応の検証を行った。HAAから2-hydrazineylideneacetyl基への変換反応は過去に生合成経路が報告されているtriacsin生合成経路と同様に起こると予想された。そこで、これらの生合成に関わると予想される、AzsS, AzpP, AzsQ, AzsFの組換えタンパク質を精製し、それらの機能をin vitroで解析した。しかし、反応が最後まで進行しなかった。そこで、AzsTをさらにこの反応に加えたところ、キャリアータンパク質であるAzsQに結合した2-hydrazineylideneacetyl基の合成が確認された。さらに下流の反応を触媒すると予想された、AzsD, AzsN, AzsO, AzsBの解析を試みた。合成した基質を用いて反応を行った結果、これらの酵素が働くことで、O-(2-hydrazineylideneacetyl)serineが合成されることが示された。この化合物がさらになんらかの酸化酵素によって酸化されることで、azaserineが生合成されると予想される。
2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成機構に関して
Nybomycinの生合成経路において2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成を担うと予想される3つの酵素 (NybC, N, O) をStreptomyces albusで異種発現した結果、この化合物のN-acetyl化体が得られていた。そこで、これらの酵素を一つずつ発現系から除き、どの酵素が生合成に必須か確認した結果、いずれの酵素も2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成に必須であることがわかった。さらに、これらの酵素を用いてin vitro解析を試みたが、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成をin vitroで再現できなかった。そのため、未知の補酵素などが、これらの反応に必要な可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Azaserineの生合成研究においてはin vitro解析を用いて、azaserineの生合成経路のほとんどの反応を解析することに成功した。また、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成に関しては異種発現系を用いた解析により、着実に反応に必要な要素が絞り込めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
Azaserineの生合成機構に関して
O-(2-hydrazineylideneacetyl)serineからazaserineの合成を触媒する酵素の候補は2つ存在する。これらの異種発現系を用いた破壊により、中間体の検出とそれらが実際にジアゾ基の生合成に必要か確認する。次に、これらの酵素のin vitro解析をこころみる。O-(2-hydrazineylideneacetyl)serineを有機化学的に合成し、それを用いてin vitro解析を行う。また、azaserineの類縁体を生産すると考えられる二次代謝産物生合成遺伝子クラスターが複数見つかっている。これらの異種発現を通して新規なジアゾ基含有化合物の発見を目指す。
2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成機構に関して
2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成酵素のin vitro解析を目指す。これらの酵素と放線菌の細胞抽出物などをもちいてin vitro反応を行い、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成に必要な因子の特定を目指す。また、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成遺伝子を持つ、二次代謝産物生合成遺伝子クラスターを異種発現し、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸由来の新たな天然物の発掘を目指す。
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