| 研究課題/領域番号 |
23K23461
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02194 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分37010:生体関連化学
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
中野 実 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 教授 (70314226)
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| 研究分担者 |
池田 恵介 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 准教授 (00553281)
中尾 裕之 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (00805020)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)
2025年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2024年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2023年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2022年度: 8,710千円 (直接経費: 6,700千円、間接経費: 2,010千円)
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| キーワード | リン脂質 / フリップフロップ / 蛍光 / 中性子散乱 / スクランブラーゼ / ペプチド |
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| 研究開始時の研究の概要 |
生体膜は脂質二重層構造からなり、通常、膜の内層側に局在するホスファチジルセリン(PS)は細胞死（アポトーシス）の際に外側へ露出する。これにより、露出したPSをマクロファージが認識し、細胞を貪食する。このようなリン脂質の表裏間の移動（フリップフロップ）は膜タンパク質により制御されている。われわれは、リン脂質のフリップフロップを誘起する合成ペプチドを見いだした。この機能をさらに活性化できれば、特定の細胞をマクロファージによりクリアランスする技術を達成できる。本研究では、モデル脂質膜や培養細胞系でリン脂質フリップフロップを計測してペプチドの最適化を行い、この新しい細胞クリアランス技術の創成を目指す。
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| 研究実績の概要 |
膜貫通配列の中央に親水性のグルタミン(Q)を１残基有し、N末端に親水性配列(RRRR)を有するペプチド4RQをFmoc固相合成法により合成した。このペプチドが添加により速やかにリン脂質ベシクルに組み込まれ、リン脂質のフリップフロップを促進することを、NBD脂質を用いた蛍光消光法により明らかにした。培養細胞に4RQを添加すると、通常は細胞膜の内層に局在するホスファチジルセリン(PS)が外層に露出することが判明し、ペプチドが細胞膜リン脂質のフリップフロップを促進したことが示唆された。次に、さらに高い活性をもつPS露出ペプチドの開発の検討を行った。リン脂質ベシクルを用いたNBD蛍光消光法の結果、２つの親水性残基を膜貫通ヘリックスの同一面上にもつペプチド4RRHおよび4R2Qが、4RQよりも高いフリップフロップ促進能を有することを示した。ペプチドのPS露出活性をHEK293細胞を用いてフローサイトメトリーにより評価したところ、4RQによりPSを表出した細胞の割合は約20％であったのに対し、4R2Qと4RRHによりPSを表出した細胞はそれぞれ約40％、50％であった。このことから、4RRHおよび4R2Qはスクランブラーゼ様の活性をもち、これらを細胞に添加すると人工的にPSの表出を誘起できることが明らかになった。興味深いことに、ペプチドを添加した細胞において、細胞膜から小胞が生成される様子が観察された。スクランブラーゼの作用によって同様の現象が起こることが知られていることから、ペプチドのスクランブラーゼ様の活性がこの現象を引き起こしたと考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ペプチドの構造と活性の間で、予想通りの相関が得られており、より高活性のペプチドをデザインする上で有益な情報が得られている。また、ペプチドの細胞への作用に関し、興味深い現象が見られおり、研究展開の目処が立っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究で、高いリン脂質フリップフロップ誘起活性が示されたペプチドについて、蛍光法および中性子散乱法によりフリップフロップ速度を計測し、その温度依存性から活性化パラメーターを算出し、フリップフロップ誘起メカニズムを明らかにする。
フリップフロップ誘起ペプチドを細胞に添加すると、細胞膜のスクランブラーゼが活性化されたときと同様の細胞応答が生じると予測されるため、細胞での変化を評価する。特に、細胞膜からベシクルが生成する様子をタイムラプス蛍光顕微鏡により観察する。また細胞外に放出されるベシクルを超遠心法により回収し、回収画分に含まれる脂質、タンパク質を分析し、ベシクルが細胞膜由来であるかどうかを確かめる。さらに、これらのベシクルが他の細胞に取り込まれるかどうかを蛍光顕微鏡観察により評価し、細胞間コミュニケーションの制御の可能性を検討する。
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