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小胞体内液液相分離の作用機序解明と化学的制御

研究課題

研究課題/領域番号 23K23472
補助金の研究課題番号 22H02205 (2022-2023)
研究種目

基盤研究(B)

配分区分基金 (2024)
補助金 (2022-2023)
応募区分一般
審査区分 小区分37020:生物分子化学関連
研究機関東北大学

研究代表者

奥村 正樹  東北大学, 学際科学フロンティア研究所, 准教授 (50635810)

研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2024年度)
配分額 *注記
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2024年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
2023年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2022年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
キーワード相分離 / LLPS / 酸化的フォールディング / 小胞体 / 化学制御 / 液滴 / レドックス / 溶液構造解析
研究開始時の研究の概要

小胞体内酵素・シャペロンであるProtein Disulfide Isomerase (PDI) familyのひとつが相分離する現象を発見し、レドックス制御を受けることを発見した。本課題では小胞体を更に区画化する機序を探求し、世界に先駆けて小胞体内液液相分離の学理を構築する。さらにチオール含有のレドックス低分子化合物によって細胞内の小胞体内液液相分離の化学制御を目指し、細胞内タンパク質品質管理の革新的な技法を提示する。
本課題の達成は小胞体内の新生タンパク質フォールディングに対し、どのようにレドックスという化学パラメータの情報を相分離現象に伝達しているのかという機序の解明に繋がる。

研究実績の概要

これまでin vitroの実験結果から、天然変性領域を持たない小胞体局在シャペロンが相分離することを示しており、本年度は細胞内構造解析を目指す条件検討を、U2OS細胞を用いて行った。U2OS細胞を用いて、安定発現株の作成に成功した。小胞体内相分離の生理学的意義を追求するため、U2OS細胞を用いて、免疫沈降法を用いて検証した結果、細胞内fociを確認することが出来た。現在、クライオ電顕トモグラフィー(cryoET)の条件検索を行っており、世界に先駆けて、小胞体内の新たな区画の可視化に挑戦している。
小胞体局在シャペロンの相分離が特定の基質・シャペロンを濃縮するかどうかを蛍光ラベル化を施し、蛍光顕微鏡およびホログラフィック顕微鏡で検証した。その結果、幾種かのシャペロン、基質の濃縮の可視化に成功し、濃縮における選択性を示すことが出来た。その結果、本化学的触媒反応場に取り込まれる因子を同定し、本反応場内の屈折率の変化を追うことが可能となった。特定の因子を取り込んだ本液滴は、基質であるプロインスリンの凝集を抑制し、酸化的フォールディングを触媒するスーパーエンハンサーとしての化学触媒反応場であることを突き止めた。今後論文化を目指す。
さらに、小胞体内相分離を形成するシャペロンは酸化還元触媒活性を保有するため、化合物による本相分離の制御が可能になると考えられる。そこで、汎用的に使用されるグルタチオンに替わる幾種かの新規チオール化合物を開発し、幅広くシャペロンの活性を増強することを突き止め、現在論文投稿中である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の計画に比べ、1. 細胞内fociの評価、2. 細胞内構造解析への着手、3. 機能評価において、どれも格段の進展がみられ、現在論文を投稿準備中であることからも当初の計画以上に進展している。
また、4. 酸化還元依存的に相分離現象の制御も示しつつあり、5. その制御因子である新規化合物の開発も進んでおり、当初の計画以上に進展しているを選定した。

今後の研究の推進方策

今後、小胞体内相分離の生命現象を世界に先駆けて証明するために、クライオ電顕トモグラフィー(cryoET)による小胞体内の可視化が重要な課題である。既に、ターゲット因子の安定発現細胞の作製に成功しており、今後測定条件を最適化し、cryoETによる小胞体内の可視化に挑戦する。
機能評価として、試験管内実験から、本液滴は、基質であるプロインスリンの凝集を抑制し、酸化的フォールディングを触媒するスーパーエンハンサーとしての化学触媒反応場であることを突き止めた。今後リバイスのことを考慮し、細胞内での機能評価の検証を進める必要がある。すなわち、本因子の過剰発現などにより、インスリン分泌量の変化を検証する必要がある。
さらに新規チオール化合物の開発が進んでいるが、本相分離現象への影響を今後in vitroで見積もり、最終的に細胞内評価する必要がある。

報告書

(2件)
  • 2023 実績報告書
  • 2022 実績報告書
  • 研究成果

    (31件)

すべて 2024 2023 2022 その他

すべて 国際共同研究 (4件) 雑誌論文 (6件) (うち国際共著 1件、 査読あり 6件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (17件) (うち国際学会 4件、 招待講演 16件) 図書 (2件) 備考 (2件)

  • [国際共同研究] ケース・ウェスタン・リザーブ大学(米国)

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [国際共同研究] Korea Basic Science Institute(韓国)

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [国際共同研究] 韓国基礎科学研究所(韓国)

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [国際共同研究] Univerity of Glasgow(英国)

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [雑誌論文] Enzymatic and synthetic regulation of polypeptide folding2024

    • 著者名/発表者名
      Muraoka Takahiro、Okumura Masaki、Saio Tomohide
    • 雑誌名

      Chemical Science

      巻: 15 号: 7 ページ: 2282-2299

    • DOI

      10.1039/d3sc05781j

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Diselenide-bond replacement of the external disulfide bond of insulin increases its oligomerization leading to sustained activity2023

    • 著者名/発表者名
      Arai Kenta、Okumura Masaki、Lee Young-Ho、Katayama Hidekazu、Mizutani Kenji、Lin Yuxi、Park Sam-Yong、Sawada Kaichiro、Toyoda Masao、Hojo Hironobu、Inaba Kenji、Iwaoka Michio
    • 雑誌名

      Communications Chemistry

      巻: 6 号: 1 ページ: 258-258

    • DOI

      10.1038/s42004-023-01056-4

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Semi-enzymatic acceleration of oxidative protein folding by <i>N</i>-methylated heteroaromatic thiols2023

    • 著者名/発表者名
      Okada Shunsuke、Matsumoto Yosuke、Takahashi Rikana、Arai Kenta、Kanemura Shingo、Okumura Masaki、Muraoka Takahiro
    • 雑誌名

      Chemical Science

      巻: 14 号: 28 ページ: 7630-7636

    • DOI

      10.1039/d3sc01540h

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Oxidative Protein Folding Promotion by Imidazoyl-conjugated Thiol2023

    • 著者名/発表者名
      Okada, S., Matsumoto, Y., Okumura, M., and Muraoka, T.*
    • 雑誌名

      Chem.Lett.

      巻: 52 ページ: 202-205

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Biophysical elucidation of neural network and chemical regeneration of neural tissue2022

    • 著者名/発表者名
      Takahiro Muraoka, Tomohide Saio, Masaki Okumura
    • 雑誌名

      Biophysics and Physicobiology

      巻: 19 号: 0 ページ: n/a

    • DOI

      10.2142/biophysico.bppb-v19.0024

    • ISSN
      2189-4779
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Cysteine-based protein folding modulators for trapping intermediates and misfolded forms2022

    • 著者名/発表者名
      Nishino, H., Kitamura, M., Okada, S., Miyake, R., Okumura, M., and Muraoka, T.*
    • 雑誌名

      RSC Advances

      巻: 12 ページ: 26658-26664

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] フォールディングとアンフォールディングの自在操作の実現2024

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      日本化学会 第104春季年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 小胞体局在因子による液滴の内部構造と機能の相関研究2024

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      大阪大学蛋白質研究所セミナー/第8回LLPS研究会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 細胞における遅延制御反応場の形成機構と機能発現の探求2024

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      日本化学会 第104春季年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 小胞体内相分離の理解2023

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      第23回 日本蛋白質科学会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Elucidating the enzymatic reductive unfolding mechanism of spike/envelope proteins to guide anti-virus activities2023

    • 著者名/発表者名
      Shingo Kanemura, Rina Hashimoto, Motonori Matsusaki, Takuya Mabuchi, Mai Watabe, Tomohide Saio, Kazuo Takayama, Young-Ho Lee, Masaki Okumura
    • 学会等名
      第23回 日本蛋白質科学会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Discovery of a transient reaction field in the endoplasmic reticulum2023

    • 著者名/発表者名
      Masaki Okumura
    • 学会等名
      International Cross-disciplinary Symposium
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] PDI familyによる小胞体内プロインスリンのフォールディング触媒機構の理解2023

    • 著者名/発表者名
      倉持円来, 関凪沙, 荒井堅太, 山口宏, 稲葉謙次, 金村進吾, 奥村正樹
    • 学会等名
      第46回分子生物学会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] フォールディングの酵素学的速度制御2023

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      第46回分子生物学会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 各生物学的階層におけるタンパク質品質管理の理解2023

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      神戸学院大学セミナー 知の創造セミナー 4回目
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Understanding the mechanism by which Protein Disulfide Isomerase (PDI) family guide proper oxidative folding2023

    • 著者名/発表者名
      Masaki Okumura
    • 学会等名
      Zoominar "Amyloid Symposium"
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 基質触媒におけるPDI酵素群の動的会合体形成の理解2023

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      日本化学会 第103春季年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 各階層における酸化的フォールディング触媒システムの理解2022

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      第22回 日本蛋白質科学会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Structural insights into the protein control system mechanism by PDI family, the endoplasmic reticulum-resident chaperone/enzyme2022

    • 著者名/発表者名
      Masaki Okumura
    • 学会等名
      Protein Folding, Aggregation, Misfolding Disease, and Disease Crosstalk
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Protein Disulfide Isomerase family; their molecular actions and functions2022

    • 著者名/発表者名
      Masaki Okumura
    • 学会等名
      Redox Week in Sendai 2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 小胞体内における酸化的フォールディング触媒ネットワークの理解2022

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      第95回 日本生化学会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] PDIファミリーのシャペロン機能の理解:プロテオスタスと神経変性疾患2022

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      第45回 日本分子生物学会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] ホログラフィック顕微鏡を用いた相分離観察例の紹介2022

    • 著者名/発表者名
      奥村正樹
    • 学会等名
      第45回 日本分子生物学会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [図書] 月刊細胞 特集「LC(Low-Complexity)ドメインの生物学」2024

    • 著者名/発表者名
      渡部マイ, 金村進吾, 李映昊, 奥村正樹
    • 総ページ数
      78
    • 出版者
      ニューサイエンス社
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [図書] 小胞体ジスルフィド結合触媒ネットワークを支える酵素群の構造基盤2022

    • 著者名/発表者名
      金村進吾, 稲葉謙次, 奥村正樹
    • 総ページ数
      2
    • 出版者
      日本結晶学会誌 64,209-210
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [備考] 東北大学奥村研

    • URL

      https://web.tohoku.ac.jp/okumura/#

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [備考] ラボホームページ

    • URL

      https://web.tohoku.ac.jp/okumura/

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書

URL: 

公開日: 2022-04-19   更新日: 2024-12-25  

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