新規可逆的リジン修飾化学の開発とコバレントドラッグ創薬の標的拡張

• 研究課題/領域番号: 23K23489
• 補助金の研究課題番号: 22H02222 (2022-2023)
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 基金 (2024); 補助金 (2022-2023)
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分37030:ケミカルバイオロジー関連
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 進藤 直哉 九州大学, 薬学研究院, 講師 (20722490)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円); 2024年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円); 2023年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円); 2022年度: 5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円)
• キーワード: コバレントドラッグ / リジン / ケミカルバイオロジー / 創薬化学

研究開始時の研究の概要

本研究では、タンパク質のリジン残基と可逆的に共有結合する新規反応基を開発し、コバレントドラッグ創薬に応用する。標的タンパク質と共有結合するコバレントドラッグは、持続的な薬効などの利点から近年注目されている。システイン残基を狙ったコバレントドラッグ創薬が盛んな一方、プロテオーム中に豊富に存在するリジン残基を狙うことで、標的可能なタンパク質領域の飛躍的拡大が期待できる。また、非特異反応による毒性懸念を最小限にするためには、非特異付加体が可逆的に解離することが望ましい。本研究ではリジンの可逆的共有結合修飾のための新たな分子デザインとして、β-フルオロビニルスルホンを提案する。

研究実績の概要

コバレントドラッグは、共有結合の形成によって標的タンパク質の機能を不可逆的に阻害する。強く持続的な薬効などの利点から、標的と選択的に共有結合するよう合理的にデザインされたコバレントドラッグが盛んに開発されており、システイン残基を狙ったチロシンキナーゼやKRAS G12C変異タンパク質阻害剤が様々上市されている。システイン残基はチオールの高い求核性に加え、プロテオーム中の存在割合が低く選択性確保の面でも有利である反面、標的可能なタンパク質は制限される。これに対し、プロテオーム中に豊富に存在するリジン残基を狙うことで、標的可能なタンパク質の飛躍的な拡張が期待できる。一方、毒性懸念を最小限に抑えるためには、非特異反応による共有結合付加体が可逆的に解離することが望ましい。本研究では、リジンの可逆的共有結合修飾を可能とする新たな分子デザインとして、β-フルオロビニルスルホン (FVS) を提案し、有機化学的な基礎検討およびコバレントドラッグ創薬への応用を検討している。これまでにFVSがアミンと可逆的に共有結合することを明らかとしたが、チオールとの不可逆的な結合が問題であった。アミン選択性向上を目指し種々検討を実施したが、チオール反応性を排除することは困難であった。FVSがタンパク質のリジン残基を共有結合修飾可能であることを実証するため、遊離チオール基を持たない熱ショックタンパク質90 (Hsp90) のFVS型コバレントプローブを設計・合成し、蛍光ラベル化を検討した。その結果、精製Hsp90タンパク質の共有結合ラベル化を示唆する結果を得たが、生細胞やライセートを用いた実験ではチオール反応性に由来すると思われるオフターゲットラベル化が顕著であった。現在、FVSのアミン/チオール両反応性求電子基や、チオール反応基としてのリパーパスを視野に、さらなるコバレントドラッグ応用を検討している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

β位置換基の異なる様々なFVS誘導体を合成し、アミンとチオールのモデル求核剤としてそれぞれN-アセチルリジン、グルタチオン (GSH) との反応をHPLCで追跡し、半減期を算出した。なお、N-アセチルリジンとの反応はpH 9.3、GSHとの反応はpH 7.2で行った。これらの条件では、両反応系中における求核種 (それぞれ遊離アミノ基とチオレート) の濃度が理論上同一となる。アミンとチオールそれぞれとの反応速度の比からアミン選択性を評価したが、β-メチルFVSで約1:1の選択性となったのが最大で、チオールと比べアミン反応性が大幅に高いFVS誘導体は見られなかった。選択性に課題を残したものの、FVSが標的タンパク質のリジン残基を共有結合修飾可能であることを実証するため、熱ショックタンパク質90 (Hsp90) を狙ったFVS型コバレントプローブを設計・合成した。Hsp90はシステイン残基を持たず、既知のリジン反応基を有するコバレント阻害剤が報告されているため、 モデル標的として最適である。プローブにはアルキンタグを導入し、精製Hsp90タンパク質と反応させたのちにクリックケミストリーにより蛍光色素を導入してゲル内蛍光解析を行った。その結果、FVS型コバレントプローブ処理によってHsp90の蛍光バンドが観察され、共有結合ラベル化の進行が示唆された。そこで、生細胞中のHsp90のラベル化を試みたが、オフターゲットラベル化が多く見られ、既存のHsp90阻害剤との競合実験等を行ったもののHsp90ラベル化の確たる証拠は得られなかった。FVSプローブによるオフターゲットラベル化は、システイン残基を網羅的にラベル化するN-エチルマレイミドで前処理したライセート中では大きく減弱したことから、FVSとシステインチオールとの反応に由来することが示唆された。

今後の研究の推進方策

今後は引き続き、FVSを用いたコバレントドラッグ創薬を検討する。FVSの置換基を種々検討したものの、チオール反応性を排除することは困難であったため、アミンとチオール両方に反応性を示す点を活かした検討を行う。具体的には、EGFRを標的としたFVS型コバレントドラッグの創製を目指す。EGFRは上皮細胞の増殖に関わるチロシンキナーゼで、非小細胞肺がんの創薬標的として重要である。ATPポケットに結合する可逆阻害剤が開発されたが、ゲートキーパー残基の変異 (T790M) による獲得耐性が見られることから、ATPポケット近傍のCys797と共有結合するコバレントドラッグが開発された。EGFR-T790Mを選択的に阻害するオシメルチニブがブロックバスターとなっているが、C797S変異による感受性の喪失が新たに問題となっている。そこで、Cys７９７との共有結合によってEGFR-T790Mを阻害し、T790M/C797S変異体に対しては触媒性Lys745との共有結合によってキナーゼ活性を阻害するFVS型コバレントドラッグの開発を目指す。ピリミジンを母核とする第三世代EGFR阻害剤とEGFRの共結晶構造から、Cys797とLys745双方に届きうる位置にFVSを導入した阻害剤をデザインし、精製キナーゼタンパク質や生細胞の蛍光ラベル化を検討する。また、アクリルアミドやフッ素のない通常のビニルスルホンは、β置換基の導入により著しくチオール反応性が低下するのに対し、FVSはβ位に芳香環などのかさ高い置換基を有していても無置換アクリルアミドと同等のチオール反応性を示す。この特徴を利用し、β位置換基を多様化可能なチオール反応基としてFVSをリパーパスする検討も行う。チロシンキナーゼのひとつBTKを対象にFVS型コバレントプローブを開発し、アクリルアミド型プローブとのプロテオーム反応性の差異を検証する。

研究成果

• [雑誌論文] コバレントドラッグのための細胞内反応化学 (2024)
  • 著者名/発表者名: 進藤直哉、王子田彰夫
  • 雑誌名: 有機合成化学協会誌 巻: 82 号: 1 ページ: 50-62
  • DOI: 10.5059/yukigoseikyokaishi.82.50
  • ISSN: 0037-9980, 1883-6526
  • 年月日: 2024-01-01
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expanding the chemistry of dihaloacetamides as tunable electrophiles for reversible covalent targeting of cysteines (2023)
  • 著者名/発表者名: Daiki Yamane, Ryo Tetsukawa, Naoki Zenmyo, Kaori Tabata, Yuya Yoshida, Naoya Matsunaga, Naoya Shindo, Akio Ojida
  • 雑誌名: Journal of Medicinal Chemistry 巻: 66 号: 13 ページ: 9130-9146
  • DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c00737
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of Tumor-Derived C-C Motif Chemokine Ligand 2 Expression Attenuates Tactile Allodynia in NCTC 2472 Fibrosarcoma-Inoculated Mice (2023)
  • 著者名/発表者名: Taniguchi Marie、Yasukochi Sai、Yamakawa Wakaba、Tsurudome Yuya、Tsuruta Akito、Horiguchi Michiko、Ushijima Kentaro、Yamashita Tomohiro、Shindo Naoya、Ojida Akio、Matsunaga Naoya、Koyanagi Satoru、Ohdo Shigehiro
  • 雑誌名: Molecular Pharmacology 巻: 104 号: 2 ページ: 73-79
  • DOI: 10.1124/molpharm.123.000690
  • 査読あり
• [雑誌論文] Beneficial effects of a new neuroprotective compound in neuronal cells and MPTP-administered mouse model of Parkinson's disease (2023)
  • 著者名/発表者名: Izumi Kato, Yudai Ogawa, Fumika Yakushiji, Jiro Ogura, Masaki Kobayashi, Naoya Shindo, Satoshi Ichikawa, Katsumi Maenaka, Masahiro Sakaitani
  • 雑誌名: Chemical Communications 巻: 59 号: 82 ページ: 12306-12309
  • DOI: 10.1039/d3cc03069e
  • 査読あり
• [雑誌論文] Discovery of chlorofluoroacetamide-based covalent inhibitors for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 3CL protease (2022)
  • 著者名/発表者名: Yuya Hirose, Naoya Shindo, Makiko Mori, Satsuki Onitsuka, Hikaru Isogai, Rui Hamada, Tadanari Hiramoto, Jinta Ochi, Daisuke Takahashi, Tadashi Ueda, Jose M. M. Caaveiro, Yuya Yoshida, Shigehiro Ohdo, Naoya Matsunaga, Shinsuke Toba, Michihito Sasaki, Yasuko Orba, Hirofumi Sawa, Akihiko Sato, Eiji Kawanishi, Akio Ojida
  • 雑誌名: Journal of Medicinal Chemistry 巻: 65 号: 20 ページ: 13852-13865
  • DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01081
  • 査読あり
• [学会発表] リジン選択的な共有結合修飾を指向した新規反応化学の開発 (2024)
  • 著者名/発表者名: 田中雄大, 谷川敦哉, 善明直輝1, 鉄川 涼, 喜多俊介, 前仲勝美, 進藤直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 日本化学会第104春季年会
• [学会発表] システインホルミル化による標的タンパク質選択的切断法の開発と機能制御応用 (2024)
  • 著者名/発表者名: 善明直輝, 松本侑也, 安田斉弘, 内之宮祥平, 進藤直哉. 田畑香織, 王子田彰夫
  • 学会等名: 日本化学会第104春季年会
• [学会発表] システインフルオロアセチル化によるアミド結合切断法の開発 (2024)
  • 著者名/発表者名: 松本侑也, 善明直輝, 安田斉弘, 内之宮祥平, 進藤直哉, 田畑香織, 王子田彰夫
  • 学会等名: 日本化学会第104春季年会
• [学会発表] システインの可逆的共有結合修飾を指向したジハロアセタミド化学の拡張 (2024)
  • 著者名/発表者名: 進藤直哉, 山根太輝, 鉄川 涼, 善明直輝, 田畑香織, 吉田優哉, 松永直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 日本薬学会第144年会
• [学会発表] 構造多様化が可能なマイケルアクセプターを用いたコバレントドラッグの開発 (2024)
  • 著者名/発表者名: 渡邉俊佑, 川本真暉, 徳永啓佑, 進藤直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 日本薬学会第144年会
• [学会発表] ケージング可能なリジン反応基を用いたマルチキナーゼ阻害剤の開発 (2024)
  • 著者名/発表者名: 谷川敦哉, 田中雄大, 善明直輝, 進藤直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 日本薬学会第144年会
• [学会発表] リジンの共有結合修飾を指向した新規反応化学の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 田中雄大, 谷川敦哉, 善明直輝, 徳永啓佑, 進藤直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会第17回年会
• [学会発表] β-フルオロビニルスルホンアミドのコバレントドラッグ創薬への応用 (2023)
  • 著者名/発表者名: 渡邉俊佑, 川本真暉, 廣瀬侑也, 徳永啓佑, 田中雄大, 進藤直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会第17回年会
• [学会発表] システインホルミル化を利用した標的選択的なタンパク質化学切断法の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 善明直輝, 松本侑也, 安田斉弘, 内之宮祥平, 進藤直哉, 田畑香織, 王子田彰夫
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会第17回年会
• [学会発表] CFA基を導入したSARS-CoV-2 3CLプロテアーゼコバレント阻害剤の創製 (2023)
  • 著者名/発表者名: 廣瀬侑也, 進藤直哉, 鬼塚さつき, 高橋大輔, Caaveiro Jose, 松永直哉, 澤洋文, 佐藤彰彦, 川西英治, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第33回万有福岡シンポジウム
• [学会発表] コバレントドラッグを指向したリジン化学選択的求電子基の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 谷川敦哉, 田中雄大, 善明直輝, 田畑香織, 進藤直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第60回化学関連支部合同九州大会
• [学会発表] コバレントドラッグを指向したリジン選択的反応化学の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 進藤直哉, 田中雄大, 谷川敦哉, 善明直輝, 徳永啓佑, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第38回創薬セミナー
• [学会発表] 多様なβ位置換基を許容するマイケルアクセプター型反応基の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 渡邉俊佑, 川本真暉, 徳永啓佑, 進藤直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第38回創薬セミナー
• [学会発表] Cysホルミル化によるタンパク質化学切断法の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 善明直輝, 松本侑也, 徳永啓佑, 安田斉弘, 内之宮祥平, 進藤直哉, 田畑香織, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第38回創薬セミナー
• [学会発表] CFA基を用いたSARS-CoV-2メインプロテアーゼに対するコバレントドラッグの開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 廣瀬侑也, 進藤直哉, 鬼塚さつき, 高橋大輔, Caaveiro Jose, 松永直哉, 澤洋文, 佐藤彰彦, 川西英治, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第38回創薬セミナー
• [学会発表] Cys修飾によるタンパク質切断法の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松本侑也, 善明直輝, 安田斉弘, 内之宮祥平, 進藤直哉, 田畑香織, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第17回バイオ関連化学シンポジウム
• [学会発表] タンパク質の共有結合阻害を指向した細胞内反応化学 (2023)
  • 著者名/発表者名: 進藤直哉
  • 学会等名: 第96回日本生化学会大会
  • 招待講演
• [学会発表] コバレントドラッグを指向したリジン選択的反応化学の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 進藤直哉, 田中雄大, 谷川敦哉, 善明直輝, 鉄川涼, 林?城, 喜多俊介, 前仲勝実, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第40回メディシナルケミストリーシンポジウム
• [学会発表] システインの可逆的共有結合修飾を指向したジハロアセタミド化学の拡張 (2023)
  • 著者名/発表者名: 鉄川涼, 山根太輝, 善明直輝, 田畑香織, 吉田優哉, 松永直哉, 進藤直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第40回メディシナルケミストリーシンポジウム
• [学会発表] β-フルオロビニルスルホンアミドを反応基とするコバレントドラッグの開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 渡邉俊佑, 川本真暉, 徳永啓佑, 進藤直哉, 王子田彰夫
  • 学会等名: 第40回メディシナルケミストリーシンポジウム
• [学会発表] コバレントドラッグを指向した細胞内反応化学の探索 (2023)
  • 著者名/発表者名: 進藤直哉
  • 学会等名: 第24回 スクリプス・バイオメディカルフォーラム
  • 招待講演
• [学会発表] β-フルオロビニルスルホンアミドを活用するシステイン残基選択的なコバレント阻害剤の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 渡邉俊佑、川本真暉、廣瀬侑也、徳永啓佑、田中雄大、進藤直哉、王子田彰夫
  • 学会等名: 日本化学会第103春季年会
• [学会発表] システイン化学修飾を利用したタンパク質化学切断法の開発: 1. システインホルミル化の化学特性解明 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松本侑也、善明直輝、安田斉弘、内之宮祥平、進藤直哉、田畑香織、王子田彰夫
  • 学会等名: 日本薬学会第143年会
• [学会発表] システイン化学修飾を利用したタンパク質化学切断法の開発: ② Cysホルミル化によるタンパク質配列選択的切断および細胞表層応用 (2023)
  • 著者名/発表者名: 善明直輝、松本侑也、安田斉弘、内之宮祥平、進藤直哉、田畑香織、王子田彰夫
  • 学会等名: 日本薬学会第144年会
• [学会発表] リジンの可逆的共有結合修飾を指向した新規反応化学の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 田中雄大、谷川敦哉、徳永啓佑、進藤直哉、王子田彰夫
  • 学会等名: 日本薬学会第144年会
• [学会発表] SARS-CoV-2の3CLプロテアーゼを標的としたCFA基を有するコバレント阻害剤の創製 (2023)
  • 著者名/発表者名: 廣瀬侑也、進藤直哉、鬼塚さつき、高橋大輔、Caaveiro Jose、松永直哉、澤洋文、佐藤彰彦、川西英治、王子田彰夫
  • 学会等名: 日本薬学会第144年会
• [学会発表] 光学活性なCFA基を導入したSARS-CoV-2メインプロテアーゼ阻害剤の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 山根太輝、進藤直哉、鬼塚さつき、李秀栄、水口賢司、川西英治、王子田彰夫
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会第16回年会
• [学会発表] リジンの可逆的共有結合修飾を指向した新規反応化学の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 田中雄大、徳永啓佑、廣瀬侑也、進藤直哉、王子田彰夫
  • 学会等名: 第59回化学関連支部合同九州大会
• [学会発表] 不可逆阻害剤への応用を目指したひずみ解消型反応基の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 松本侑也、善明直輝、安田斉弘、内之宮祥平、進藤直哉、田畑香織、王子田彰夫
  • 学会等名: 第60回化学関連支部合同九州大会
• [学会発表] 生体内の標的タンパク質を選択的に狙うコバレントドラッグの有機化学 (2022)
  • 著者名/発表者名: 進藤直哉
  • 学会等名: 第55回天然物化学談話会
  • 招待講演
• [学会発表] システインホルミル化によるタンパク質部位選択的な化学切断法の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 善明直輝、松本侑也、安田斉弘、内之宮祥平、進藤直哉、田畑香織、王子田彰夫
  • 学会等名: 第16回バイオ関連化学シンポジウム
• [学会発表] 標的タンパク質を狙い撃ちするコバレントドラッグの有機化学 (2022)
  • 著者名/発表者名: 進藤直哉
  • 学会等名: 徳島大学研究クラスター「独自の解析技術と疾患科学の融合によるリボソーム創薬の創生」第3回セミナー
  • 招待講演
• [図書] 生体分子環境の化学 (2023)
  • 著者名/発表者名: 日本化学会編、進藤直哉、王子田彰夫
  • 総ページ数: 208
  • 出版者: 化学同人
  • ISBN: 9784759814057