| 研究課題/領域番号 |
23K23530
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02263 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38030:応用生物化学関連
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| 研究機関 | 富山県立大学 |
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研究代表者 |
榊 利之 富山県立大学, 工学部, 研究員 (70293909)
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| 研究分担者 |
橘高 敦史 帝京大学, 薬学部, 教授 (00214833)
中西 友子 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10344863)
生城 真一 富山県立大学, 工学部, 教授 (50244679)
安田 佳織 富山県立大学, 工学部, 准教授 (70707231)
西川 美宇 富山県立大学, 工学部, 助教 (90749805)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2024年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2023年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2022年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円)
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| キーワード | ビタミンD / ビタミンD受容体 / 遺伝子治療 / シトクロムP450 / ゲノム編集 / 作用メカニズム / アデノウイルスベクター / ビタミンD誘導体 / 医薬品 / 脱毛症 / Cas9 / Cas9ニッカーゼ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
申請者はゲノム編集により、CYP27B1、VDRあるいはCYP24A1遺伝子を欠損するラットの作製に成功した。さらに、1,25D3に対する親和性が25D3と同程度にまで低下した変異型VDR-R270LをもつⅡ型くる病モデルラット、1,25D3および25D3に対する親和性がいずれも約10分の１に低下したVDR-H301QをもつⅡ型くる病モデルラット、さらには両変異をもつ二重変異体VDR-R270L/H301Qもつラットを作製した。本研究ではこれら遺伝子改変ラットを評価系として、骨粗鬆症や癌の治療薬となるビタミンD誘導体の開発を試みる。一方、VDR-KOラット、CYP27B1-KOラットにはアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療およびCRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集治療を行う
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| 研究実績の概要 |
「ビタミンＤおよびビタミンＤ受容体の作用メカニズムの全貌の解明」において、
歯のエナメル形成不全および眼の白内障が、6種の遺伝子組み換えラットの中でCYP27B1-KOのみにみられる現象であることを発見した。ビタミンDおよびVDRの作用の中で、CYP27B1-KOのみが欠損し、他のGMラットには影響のない作用はVDR非依存性1,25D3の作用であることから、歯のエナメル形成と眼の水晶体の維持にはVDR非依存性1,25D3の作用が重要であると考えられる。1,25D3-MARRS（別名ERp57あるいはPDIA3）を介した1,25D3の作用である可能性が高いと推測している。「Ⅱ型くる病VDR-H305Q患者に有効なビタミンD誘導体の開発」においては、VDR-H305Qのリガンド結合領域の両端に分割型ルシフェラーゼのＮ端側およびＣ端側を連結したキメラタンパク質を用いて多数のビタミンＤ誘導体の結合能を評価した。その結果、きわめて高い親和性を示す誘導体を見出すことができた。この誘導体はVDR-Ｒ274Ｌにも高い親和性を示し、VDR-R274L、VDR-H305Qを含む複数のII型くる病患者の治療薬になる可能性がある。「VDR-KOに基づくⅡ型くる病に対する遺伝子治療の有効性の検証」において
VDR cDNAを挿入したVDR発現アデノウイルスベクターをVDR-KOラットに皮内投与したところ、顕著な発毛促進および脱毛抑制が見られた。１か月以上、効果が持続したが恒久的な治療を目的としたゲノム編集治療を検討する。Cas9のオフターゲット問題および特許の問題を回避するため、アデノウイルスベクターに他のCas分子種を搭載したシステムの構築に着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「ビタミンＤおよびビタミンＤ受容体の作用メカニズムの全貌の解明」においては興味深いデータを多数得ており、予想以上の進捗が見られている。「Ⅱ型くる病VDR-H305Q患者に有効なビタミンD誘導体の開発」においては、VDR-H305Qにきわめて高い親和性を示す誘導体を見出すことができ、順調に進展している。「VDR-KOに基づくⅡ型くる病に対する遺伝子治療の有効性の検証」においてはCas9アデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療で顕著な成果が見られた。ゲノム編集治療についてはCas9, gRNA, donorDNAすべてを含む一体型アデノウイルスベクターを構築したが、今年度はさほど進展はみられなかった。総合的に判断すると、おおむね順調と言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
「ビタミンＤおよびビタミンＤ受容体の作用メカニズムの全貌の解明」においてはトランスクリプトーム解析とプロテオーム解析が可能になったため、各種遺伝子組み換えラットの脳、皮膚、眼、腎臓などのマルチオミックス解析に注力したい。Cyp27B1-KOラットだけに見られる歯のエナメル形成不全や白内障、ビタミンD受容体-KOラットだけに見られる脱毛症状のメカニズムを解明したい「Ⅱ型くる病VDR-H305Q患者に有効なビタミンD誘導体の開発」においては、VDR-H305Qにきわめて高い親和性を示す誘導体を見出すことができたため、これをVDR-H301Qラットに投与し、II型くる病症状が改善されるか調べる予定である。「VDR-KOに基づくⅡ型くる病に対する遺伝子治療の有効性の検証」においてはCas9アデノウイルスベクターを用いたゲノム編集治療にとどまらず、他のCas分子種についても検討したい。Cas9特許の莫大なライセンス料問題の回避が難しいからである。
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