| 研究課題/領域番号 |
23K23688
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02423 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分40030:水圏生産科学関連
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
引間 順一 宮崎大学, 農学部, 教授 (70708130)
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| 研究分担者 |
酒井 正博 宮崎大学, 農学部, 教授 (20178536)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2025年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
2024年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2023年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2022年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
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| キーワード | エドワジエラ症 / ヒラメ / メダカ / 細胞死 / ASC / 感染機構 / 病原因子 / パイロトーシス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ヒラメやマダイなどの有用養殖魚種の養殖においてエドワジエラ症は、本疾病に対する防除対策が社会的急務である。申請者は、エドワジエラ症の本質的理解には「本菌が炎症性細胞死(パイロトーシス)を一時的に回避する分子機構の解明」が鍵となることを見出した。しかし、本菌による宿主パイロトーシス回避の分子機構は全く不明である。そこで本研究では、パイロトーシスに関与する病原因子EvpPの機能欠損株を作製し、本菌感染経路に基づいた病原性と本細胞死との関係、本分子に起因する未知の宿主分子機構の探索、そして本細胞死の一時的回避メカニズムについて詳細に解析する。
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| 研究実績の概要 |
ヒラメやマダイなどの有用養殖魚種の養殖において、Edwardsiella属の数種を原因とするエドワジエラ症は、毎年甚大な被害の原因となっており、本疾病に対する防除対策が社会的急務である。申請者は、細胞内における本菌への分子認識機構に関する先行研究の成果から、エドワジエラ症の本質的理解には「本菌が炎症性細胞死(パイロトーシス)を一時的に回避する分子機構の解明」が鍵となることを見出した。しかし、本菌による宿主パイロトーシス回避の分子機構は全く不明である。そこで本研究では、パイロトーシスに関与する病原因子EvpPの機能欠損株を作製し、本菌感染経路に基づいた病原性と本細胞死との関係、EvpPに起因する未知の宿主分子機構の探索、そしてEvpPによる本細胞死の一時的回避メカニズムについて詳細に解析する。以上より、エドワジエラ症原因菌の細胞内感染経路の真のホットスポットを解明し、本感染症による養殖被害問題を解決するための防除対策に繋げる。
まず、1年目の研究計画で予定しいたEvpP欠損株の作製については、E. piscicida(ヒラメ分離株NUF806)および E. anguillarum(マダイ分離株FCP503)の2種類の株で成功させた。また、これらの内、NUF806 evpP欠損株については、ヒラメへの感染試験を実施し、NUF806野生株のヒラメへの感受性に比べて、NUF806ΔevpP欠損株による感受性は顕著に低く、全く死亡しなかった。この結果から、E. piscicidaのEvpPは、ヒラメへの感染過程において重要な病原性因子であると考えられた。さらに、EvpPの細胞内局在性を明らかにするためにNUF806-evpP+gfp株を作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1年目の研究計画として、E. piscicida(ヒラメ分離株NUF806)および E. anguillarum(マダイ分離株FCP503)の病原性株を用いて、2種類のEvpP欠損株を以下の手法で構築を試みた。既報の可動性スーサイドベクター(pRE112)を用いて、EVP遺伝子クラスター中のevpP領域を欠失させ、evpP欠損株の作製を2種類の株で成功させることができた。これらの内、NUF806 evpP欠損株を用いてヒラメに対する感染試験を実施したところ、NUF806野生株の感染区では感染7日後から死亡が認められ、最終生残率は13.3%であったのに対して、NUF806ΔevpP欠損株区では全く死亡が認められなかった。このことから、E. piscicidaのEvpPが宿主に感染する際に病原性因子として重要であることを示唆した。
次に、上述の欠損株作製と同様の手法を用いて、EvpP-C末端に蛍光タンパク質GFPを融合させたタンパク質を産生するNUF806-evpP+gfp株の作製にも成功した。現在、本株が細胞のどこでEvpP+GFPを産生するか検討中であり、2年目以降の研究計画の進捗に大きな弾みとなった。2種類のEvpP欠損株への補完株についても現在作製中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
2年目の研究計画としては、以下の２つの実験計画を実施する。
1つ目は、ヒラメと同様に、E. piscicida NUF806ΔevpP欠損株を用いてメダカに対する感染試験を実施する。また、E. anguillarum FCP503 evpP欠損株を用いたマダイ感染試験についても実施し、EvpPのメダカやマダイに対する病原性について明らかにする。これらの実験ではevpP欠損の補完株を作製し、これも併せて感染試験に使用する。さらに、E. piscicida野生株およびevpP欠損株が感染したヒラメおよびメダカの各臓器（腸管、鰓、腎臓、肝臓、脾臓など）における菌数の変化を明らかにし、EvpP病原性により細菌増殖が促されていると推定される臓器を特定する。また、可能であれば特定した臓器組織の切片を作製し、EvpPの組織内での局在についても明らかにする。
２つ目の実験計画では、上記の実験で特定したヒラメおよびメダカの臓器において、トランスクリプトーム解析(RNA -SeqやqPCR解析)を行い、EvpPによる各組織への影響の違いを網羅的に理解する。
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