| 研究課題/領域番号 |
23K23699
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02434 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分40040:水圏生命科学関連
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
中尾 実樹 九州大学, 農学研究院, 教授 (50212080)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2024年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2022年度: 9,360千円 (直接経費: 7,200千円、間接経費: 2,160千円)
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| キーワード | 魚類 / 補体 / 体表粘液 / 生体防御 / 恒常性維持 / 補体系 / 活性化 / 制御因子 / 細胞障害経路 / 免疫 / コイ / 硬骨魚類 / C3 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
魚類の体表粘液に含まれる補体系が微生物感染によって活性化された際に、微生物の排除機能を発揮する他に、体表の上皮細胞に発現する補体制御因子とも相互作用すると考えられる。この相互作用を詳細に解析することにより、微生物の侵入に対する物理的バリアとして重要な上皮細胞シートが、体表粘液における補体活性化によってどのような影響を受けるかを評価でき、粘液中補体活性化の生理的な意義の理解を深めることができる。
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| 研究実績の概要 |
体表粘液補体において、補体活性化経路の最初から最後までが実際に働きうるのかを解明するために、コイ体表粘液とウサギ赤血球・抗体感作ヒツジ赤血球を反応させて補体を活性化し、これら標的細胞の破壊状況（溶血活性）を検討したところ、補体系反応経路の最終段階である細胞溶解経路まで活性化され、膜侵襲複合体が形成されたことが判明した。この膜侵襲複合体中のコイ補体成分C5、C7およびC9の存在をウエスタンブロッティングによって検討したが、C5およびC9は検出されたものの、C7は検出限界以下であった。
上記実験で認められた粘液中での補体活性化が、すでに我々が同定したコイ補体制御因子Tecremによって抑制されるか否かを確認するために、Tecremの組換えタンパク質の発現を試みた。Tecremタンパク質をできる限り正常な構造で発言させるために、バキュロウイルス・昆虫細胞発現系によってTecremの機能ドメイン（SCR-1）の発現を行ったが、十分な量の発現には至らなかった。今後、大腸菌による大量発現を試みる。さらに、Aeromonas hydrophila菌体による、体表粘液補体の活性化については、本菌に対するコイの特異抗体を供試した、補体古典経路の活性化を証明することができた。ただし、レクチン経路を介した活性化が起こっている可能性も否定できない状況である。各経路特異的な活性化評価を行う必要がある。また、菌体への補体の詳細な作用機構をについては、フローサイトメトリーによる解析プロトコルが確立できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コイ体表粘液中の補体が、標的異物赤血球に対して、反応の最終段階である細胞溶解経路まで作用していることを示唆する知見を得られたが、その結果をサポートするための、補体成分の沈着を検出する実験において、一部の成分が検出限界以下であった点が問題点として残る。また、活性化制御の検証実験に必要な、制御因子の組換えタンパク質の生産が十分でなかった点についても、さらなるフォローアップがとなっている。これらは、2023年度末から再実験・再検討を進めており、2024年度中の早い時期に遅れを取り戻せる見込みである。
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| 今後の研究の推進方策 |
体表粘液中における補体活性化、特に細胞障害経路の活性化を分子レベルで検証する実験を進める。また、近年、魚類の補体活性化を制御するタンパク質として、新たにフィブリノーゲン分解産物が同定されたので、これによる体表粘液補体の活性化制御についてもタンパク質レベルでの検証を進め、粘液中補体の活性化と生体防御機能に関する新たな視点を提供したい。
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