| 研究課題/領域番号 |
23K23704
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02439 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分40040:水圏生命科学関連
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| 研究機関 | 神奈川大学 |
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研究代表者 |
大平 剛 神奈川大学, 理学部, 教授 (10361809)
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| 研究分担者 |
片山 秀和 帝京大学, 理工学部, 教授 (30580857)
筒井 直昭 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (00643785)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
14,170千円 (直接経費: 10,900千円、間接経費: 3,270千円)
2024年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2023年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2022年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
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| キーワード | クルマエビ / 人為催熟 / 成熟誘導ホルモン剤 / 成熟誘導 / ホルモン剤 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
赤色色素凝集ホルモン(RPCH)は新規の成熟抑制因子と考えられている。本研究では、クルマエビの成熟を誘導するRPCHアンタゴニストの開発を行う。活性に重要なアミノ酸の一部を非天然アミノ酸や修飾アミノ酸に置換し、ペプチドの末端を保護したRPCHアンタゴニストを合成し、投与実験により成熟促進活性を調べる。最終的には、RPCHアンタゴニストを餌に混ぜて経口投与し、クルマエビを人為催熟させる。
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| 研究実績の概要 |
1.赤色色素凝集ホルモン(RPCH)アンタゴニストのクルマエビへの投与実験・・・ホッコクアカエビの投与実験でRPCHアンタゴニスト活性の最も強かった分子（pQ1Imi/L2dL/N3dF/S5dF）を、1尾あたり45 μg（1 μ/g体重）ずつ片眼柄を切除した未成熟のクルマエビの雌に投与した。対照群には生理食塩水を投与した。その結果、pQ1Imi/L2dL/N3dF/S5dFの投与によりクルマエビの体色が赤くなることを期待していたが、pQ1Imi/L2dL/N3dF/S5dF投与群のほうが対照群と比べて体色が白くなった。また、pQ1Imi/L2dL/N3dF/S5dFの投与によりクルマエビのGSIが増加することを期待していたが、pQ1Imi/L2dL/N3dF/S5dF投与群のほうが対照群と比べてGSIが減少した。以上の結果より、今回投与したpQ1Imi/L2dL/N3dF/S5dFはアンタゴニスト活性よりもアゴニスト活性の方が強いと考えられた。
2.RNA干渉によるRPCHの遺伝子ノックダウン・・・上記1の実験でクルマエビの成熟が促進されなかったため、RPCHの遺伝子ノックダウン実験も並行して取り組んだ。クルマエビRPCHと緑色蛍光タンパク質(GFP)の二本鎖RNA(dsRNA)を合成した。そして、片眼柄を切除した未成熟なクルマエビの雌にRPCH dsRNAを投与し、ネガティブコントロール群にはGFP dsRNAを投与した。その結果、RPCH dsRNA投与群の方がGFP dsRNA投与群よりもGSIの値が有意に高くなった。卵巣の組織像の観察においても、RPCH dsRNA投与群の方が成熟率（外因性卵黄蓄積期の卵母細胞が観察された個体の割合）が有意に高くなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画では、RPCHアンタゴニストを投与してクルマエビの成熟を促進することを予定していた。しかし、RPCHアンタゴニストにはアンタゴニスト活性は観察されず、成熟促進も誘導されなかった。予想通りの結果が得られなかったため、RNA干渉によるRPCHの遺伝子ノックダウンによるクルマエビの成熟促進を試みた。その結果、RNA干渉によりRPCH遺伝子の発現は有意に減少し、期待通りクルマエビの成熟は促進された。
一部の計画および方法を変更したが、上記の通り2023年度は概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.RPCHアンタゴニストの投与による成熟誘導実験・・・RPCHアンタゴニストの新たな候補として、RPCHのレトロインベルソペプチドの化学合成を行う。レトロインベルソペプチドは、ペプチドのアミノ酸配列を逆転させ、かつすべてのアミノ酸をD-アミノ酸にしたペプチドのことである。このようなペプチドは、元のペプチドの分子と側鎖が同じ方向に配向し、元のペプチドと同様の立体構造を有しているため、受容体と結合し、アンタゴニスト活性を示す可能性があると考えられる。化学合成したRPCHレトロインベルソペプチドを未成熟なクルマエビに注射する。注射2週間後にRPCHレトロインベルソペプチドを投与したエビから卵巣などの器官を摘出し、GSIと成熟ステージを指標にしてRPCHレトロインベルソペプチドの投与により成熟が促進されたかどうかを評価する。
2.RPCH二本鎖RNAの投与による産卵誘導実験・・・RPCH二本鎖RNAの投与条件を最適化し、産卵の誘導を試みる。RPCH二本鎖RNAは両眼柄切除していない未成熟なクルマエビに注射する。注射後、卵巣の成熟誘導に成功した個体を産卵水槽に収容し、受精卵 を回収する。回収した受精卵を孵化させて、幼生飼育を行い、稚エビに変態後の生残率を調べる。
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