| 研究課題/領域番号 |
23K23772
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02507 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42020:獣医学関連
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
堀内 基広 北海道大学, 獣医学研究院, 教授 (30219216)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)
2024年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2023年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2022年度: 8,060千円 (直接経費: 6,200千円、間接経費: 1,860千円)
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| キーワード | プリオン病 / ミクログリア / アストロサイト / 難治性神経変性疾患 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
グリア細胞の活性化状態 (極性) を人為的に制御できれば、プリオン病の病態進行を遅延させることが可能と考えられる。そこで、本研究では、プリオン感染マウスにおける、ミクログリアおよびアストロサイトを神経保護的に極性転換させる因子および方法の同定を進め、グリア細胞の極性転換を応用した難治性神経変性疾患の病態進行制御法の開発にむけた科学的知見を蓄積することを目的とする。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、緻密骨由来間葉系幹細胞 (CB-MSCs) がアストロサイト (AS) およびミクログリア (MG) の極性転換に関与する因子の同定、および、極性が転換したグリア細胞の神経保護・傷害機能の解析を行い、グリア細胞の極性転換法を、プリオン病を含む難治性神経変性疾患の病態進行を制御する方法の開発へ応用することを目的とする。
CB-MSCsの培養上清をLPS刺激によりM1型にシフトしたMixedグリア培養由来のMGに作用させると、IL-1β、CD68の遺伝子発現が低下し、Arg-1の遺伝子発現が上昇したことから、CB-MSCsの培養上清中には、MGの活性化状態をM1型からM2型にシフトさせる因子が存在することが確かめられた。同様のことが、プリオン接種後120日のプリオン感染マウスからCD11b抗体を用いた磁気ビーズ用により回収したMGでも確認され、CB-MSCsの培養上清中には、プリオン感染脳のMGの活性化状態をM1型からM2型にシフトさせる因子が存在することが確かめられた。CB-MSCsの培養上清を100,000 xgで遠心して得たエクソソーム画分と液性因子画分を用いて同様の解析を行った結果、両方の画分にMGの活性化を調節する生物活性があったことから、MGの活性化調節に関わる因子は複数存在することが示唆された。
プリオン感染に伴いASが単独で神経傷害性を示すA1型にシフトするか調べるために、混合グリア培養からASを分離してプリオンを感染させた。約50%のASがプリオンに感染する条件下で、ASの小胞体ストレス応答をATF4-PERK経路の中心分子であるリン酸化PERKを指標に解析したが、小胞体ストレス応答が生じている結果は得られなかった。従って、今後、ASを対象に実験を進める場合、M1型のMGからの刺激により、A1型のASを誘導する必要が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
CB-MSCs培養上清のエクソソーム画分と液性因子画分の両方にMGの極性を変化させる活性があることから、両方を用いて進める必要があるが、より強い活性を有する画分の解析を優先する。CM-MSCsの培養上清中の液性因子をMulti-Plex Assayを用いて合計31のサイトカイン、ケモカインの存在を調べたが、MGの極性変化に関わる因子の同定には至っていない。本年度、MGの液性因子画分の質量分析を実施する予定であったが、エクソソーム画分と液性因子画分のMG調整活性の結果が明瞭でなかったことから、質量分析の実施は延期した。従って、MGの活性を調節する因子の探索は予定よりも遅れている。混合グリア培養からASを回収して、プリオンが効率よく感染する系を構築できた。ただし、AS単独では神経傷害型のA1型にシフトしない可能性があり、炎症性サイトカイン等M1型MGからの刺激を加える必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
質量分析によりCB-MSCs培養上清のプロテオーム解析を実施し、培養上清中に存在する液性因子の中で、MGの活性化状態をシフトさせる候補を見つけ出す。また、エクソソームを効率よく精製して、エクソソームのMG極性変化の活性を、再検証する。
本研究では、ex vivoの実験系で、M1/M2型のMGおよびA1/A2型のASの神経傷害/保護活性を解析する。現在用いているプリオン感染マウスでは、視床の神経細胞のvGlut1あるいはvGlut2陽性の興奮性神経細胞が消失することを確認している。これを模倣した実験系として、視床由来の初代神経培養細胞にプリオンが効率良く感染すること、また、神経細胞の異常を検知するマーカー分子として、ストレス誘導性転写調節因子ATF3の発現も指標とする計画であるが、酸化ストレスにより視床の神経細胞でATF3が発現することを確認している。従って、令和5年度は、早期から、神経細胞とMGあるいはASの混合培養系を用いた解析を始める。
令和4年度は、プリオン感染マウスを飼育するスペースが混雑し、十分なスペースを確保できなかったが、令和5年度はスペースが確保できることから、CXCL16-CXCR6経路のプリオン病の病態への関与を解析するための感染実験を開始する。独自に構築したグリア細胞の遺伝発現データベースの解析から、プリオン感染初期から中期にかけてMgが産生するケモカインCXCL16がAsおよびMgに発現するレセプターCXCR6を介してAsおよびMgを神経保護的にシフトさせる可能性を見いだしている。そこで、CXCR6欠損マウス導入して感染実験を行い、CXCL16-CXCR6経路の病態への関与を解析する。
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