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クライオ電顕を用いた時分割構造解析による破傷風毒素の膜侵入機構解明

研究課題

研究課題/領域番号 23K23821
補助金の研究課題番号 22H02557 (2022-2023)
研究種目

基盤研究(B)

配分区分基金 (2024)
補助金 (2022-2023)
応募区分一般
審査区分 小区分43020:構造生物化学関連
研究機関大阪大学

研究代表者

井上 豪  大阪大学, 大学院薬学研究科, 教授 (20263204)

研究分担者 安居 輝人  北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 博士研究員 (60283074)
研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2024年度)
配分額 *注記
17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)
2024年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2023年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2022年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
キーワード破傷風毒素 / クライオ電顕 / ダイナミクス / 時分割解析 / 構造変化 / クライオ電子顕微鏡 / 低温トラップ / 抗体複合体
研究開始時の研究の概要

破傷風毒素(TeNT)が中枢神経系の細胞でのみ作用する膜透過の分子機構について還元状態からS-S結合の形成に伴って膜透過ドメイン(Hn) が回転し、TeNTが活性型に変化する様子について、クライオ電顕を用いた低温トラップ法による時分割構造解析によって明らかとすることを目的として いる。また、ヒト由来の機能性抗体のエピトープも解析して、活性化メカニズムと抗体による不活化機構との相関を明らかとし、細胞膜侵入の分子機構解明を行う。

研究実績の概要

本申請では、還元型(不活性型)の破傷風毒素(TeNT)をクライオ電顕で用いるグリッドに固定化し、低pH下で酸化剤を添加して酸化型(活性型)へと構造変化させた場合の変化の過程を低温トラップ法で解析し、中枢神経系のみで膜侵入が起こる分子機構について考察することを目的としている。
本目的を達成するためには、令和3年度に導入したクライオ電顕を稼働させる必要があったが、原因不明のトラブルが続き、その解決に3年を費やしている。最終的にカメラとそれを制御するボードの総入れ替えによって漸く稼働しはじめ、24時間のテスト撮影が続いている。この間、本研究課題の標的であるTeNTの大量精製も進み、酸化体のTeNTの粒子像を撮影するための凍結条件の検討も進んでいる。
一方、他の測定装置を用い、クライオ電顕グラフェンの酸化修飾によってエポキシ基を導入した初代のクライオ電顕用の新規グリッド(Epoxidized Graphene Grid; EG-grid, Scientific Reports, 2023)を改良して、Hisタグを認識したり、マルトース結合蛋白質を認識したりする次世代型のEG-gridの開発にも成功している(未発表)。グラフェン膜上にタンパク質を効率よく固定化する技術の開発も進んでおり、EG-Grid上で破傷風毒素(TeNT)を固定化することについても計画通り実験を実施できる目途が立っている。還元剤の入った反応溶液と混合することで、構造変化を起こさせ、その直後に凍結することで、低温トラップによる構造変化をクライオ電子顕微鏡で捉える実験を進める予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

当該グループでは、グラフェンに気相反応で酸素官能基を導入できる革新的酸化反応の発見を基に、クライオ電顕用のグラフェングリッドにヒドロキシ基の導入とそれに続くエポキシ基の導入によってEG-Grid(Epoidized Graphene grid)の開発に成功している。さらに最近では、マルトースやNi-NTAを導入して、マルトース結合蛋白質やHisタグを認識できる次世代型のEG-gridの開発にも成功している。
これらのツールによってグラフェン膜上に標的タンパク質を固定化し、TCEPを含む還元剤入りの溶液を添加することでS-S結合を開裂した際の構造を低温でトラップした後に単粒子構造解析を行うことで構造変化を捉えることができると考えている。

今後の研究の推進方策

令和3年度に導入されたクライオ電子顕微鏡(ARM200)が導入当初から故障が続き、結局、Gatan製カメラとそれを制御するボードの全交換ということで漸く稼働に向けての最終調整が進められるようになり、当該研究の目標達成に向けて前進できると考えられる。

報告書

(2件)
  • 2023 実績報告書
  • 2022 実績報告書
  • 研究成果

    (15件)

すべて 2024 2023 2022

すべて 雑誌論文 (8件) (うち査読あり 8件、 オープンアクセス 8件) 学会発表 (2件) (うち招待講演 2件) 図書 (1件) 産業財産権 (4件) (うち外国 3件)

  • [雑誌論文] Characterization of a neutralizing antibody that recognizes a loop region adjacent to the receptor-binding interface of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain.2024

    • 著者名/発表者名
      Anzai I, Fujita J, Ono C, Kosaka Y, Miyamoto Y, Shichinohe S, Takada K, Torii S, Taguwa S, Suzuki K, Makino F, Kajita T, Inoue T, Namba K, Watanabe T, Matsuura Y
    • 雑誌名

      Microbiol Spectr.

      巻: 12 号: 4

    • DOI

      10.1128/spectrum.03655-23

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Structures of a FtsZ single protofilament and a double-helical tube in complex with a monobody2023

    • 著者名/発表者名
      Junso Fujita, Hiroshi Amesaka, Takuya Yoshizawa, Kota Hibino, Natsuki Kamimura, Natsuko Kuroda, Takamoto Konishi, Yuki Kato, Mizuho Hara, Tsuyoshi Inoue, Keiichi Namba, Shun-ichi Tanaka, Hiroyoshi Matsumura
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 14 号: 1 ページ: 4073-4073

    • DOI

      10.1038/s41467-023-39807-5

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] One-step antibacterial modification of polypropylene nonwoven fabrics via oxidation using photo-activated chlorine dioxide radical2023

    • 著者名/発表者名
      Yamamoto Keita、Asahara Haruyasu、Harada Kazuo、Itabashi Yuki、Ohkubo Kei、Inoue Tsuyoshi
    • 雑誌名

      Journal of Materials Chemistry B

      巻: -- 号: 23 ページ: 5101-5107

    • DOI

      10.1039/d3tb00586k

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis2023

    • 著者名/発表者名
      Fujita Junso、Makino Fumiaki、Asahara Haruyasu、Moriguchi Maiko、Kumano Shota、Anzai Itsuki、Kishikawa Jun-ichi、Matsuura Yoshiharu、Kato Takayuki、Namba Keiichi、Inoue Tsuyoshi
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 13 号: 1 ページ: 2279-2279

    • DOI

      10.1038/s41598-023-29396-0

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Immobilization of β-cyclodextrin onto polypropylene nonwoven fabric based on photooxidative surface modification2023

    • 著者名/発表者名
      Keita Yamamoto, Haruyasu Asahara, Maiko Moriguchi, Tsuyoshi Inoue
    • 雑誌名

      Polymer Journal

      巻: - 号: 5 ページ: 599-605

    • DOI

      10.1038/s41428-022-00751-8

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] A panel of nanobodies recognizing conserved hidden clefts of all SARS-CoV-2 spike variants including Omicron2022

    • 著者名/発表者名
      Ryota Maeda, Junso Fujita, Yoshinobu Konishi, Yasuhiro Kazuma, Hiroyuki Yamazaki, Itsuki Anzai, Tokiko Watanabe, Keishi Yamaguchi, Kazuki Kasai, Kayoko Nagata, Yutaro Yamaoka, Kei Miyakawa, Akihide Ryo, Kotaro Shirakawa, Kei Sato, Fumiaki Makino, Yoshiharu Matsuura, Tsuyoshi Inoue, Akihiro Imura, Keiichi Namba, Akifumi Takaori-Kondo
    • 雑誌名

      Communications Biology

      巻: 5 号: 1 ページ: 669-669

    • DOI

      10.1038/s42003-022-03630-3

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Visible-light-induced phosgenation of amines by chloroform oxygenation using chlorine dioxide2022

    • 著者名/発表者名
      Asahara Haruyasu、Takao Nozomi、Moriguchi Maiko、Inoue Tsuyoshi、Ohkubo Kei
    • 雑誌名

      Chemical Communications

      巻: 58 号: 42 ページ: 6176-6179

    • DOI

      10.1039/d2cc01336c

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Human antibody recognition and neutralization mode on the NTD and RBD domains of SARS-CoV-2 spike protein2022

    • 著者名/発表者名
      Otsubo Ryota、Minamitani Takeharu、Kobiyama Kouji、Fujita Junso、Ito Toshihiro、Ueno Shiori、Anzai Itsuki、Tanino Hiroki、Aoyama Hiroshi、Matsuura Yoshiharu、Namba Keiichi、Imadome Ken-Ichi、Ishii Ken J.、Tsumoto Kouhei、Kamitani Wataru、Yasui Teruhito
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 12 号: 1 ページ: 20120-20120

    • DOI

      10.1038/s41598-022-24730-4

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 除菌・消臭剤MA-Tの酸化制御技術を活用したクライオ電顕のツールの開発2022

    • 著者名/発表者名
      井上豪
    • 学会等名
      第3回ファーマラボEXPO東京(東京ビッグサイト)
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 除菌消臭剤MA-Tのメカニズム解明に基づく酸化制御技術の開発とその応用2022

    • 著者名/発表者名
      井上豪
    • 学会等名
      R022量子構造生物学委員会・第6回研究会(ミーティングスペースAP日本橋)
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [図書] クライオ電子顕微鏡ハンドブック2023

    • 著者名/発表者名
      難波 啓一、加藤 貴之、牧野 文信
    • 総ページ数
      460
    • 出版者
      エヌ・ティー・エス
    • ISBN
      9784860438043
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [産業財産権] グラフェングリッド、グラフェングリッドの製造方法、構造解析対象物質の構造解析方法2023

    • 発明者名
      井上豪(筆頭)ほか7名
    • 権利者名
      井上豪(筆頭)ほか7名
    • 産業財産権種類
      特許
    • 出願年月日
      2023
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [産業財産権] グラフェングリッド、グラフェングリッドの製造方法、構造解析対象物質の構造解析方法2022

    • 発明者名
      井上豪(筆頭)ほか7名
    • 権利者名
      井上豪(筆頭)ほか7名
    • 産業財産権種類
      特許
    • 出願年月日
      2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 外国
  • [産業財産権] グラフェングリッド、グラフェングリッドの製造方法、構造解析対象物質の構造解析方法2022

    • 発明者名
      井上豪(筆頭)ほか7名
    • 権利者名
      井上豪(筆頭)ほか7名
    • 産業財産権種類
      特許
    • 出願年月日
      2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 外国
  • [産業財産権] グラフェングリッド、グラフェングリッドの製造方法、構造解析対象物質の構造解析方法2022

    • 発明者名
      井上豪(筆頭)ほか7名
    • 権利者名
      井上豪(筆頭)ほか7名
    • 産業財産権種類
      特許
    • 出願年月日
      2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 外国

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公開日: 2022-04-19   更新日: 2024-12-25  

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