| 研究課題/領域番号 |
23K23828
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02564 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
山形 敦史 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (20463903)
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| 研究分担者 |
寺田 透 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (40359641)
難波 康祐 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (50414123)
村田 佳子 公益財団法人サントリー生命科学財団, 生物有機科学研究所・統合生体分子機能研究部, 特任研究員 (60256047)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2024年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2023年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
2022年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
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| キーワード | クライオ電子顕微鏡 / ムギネ酸 / 膜輸送体 / 鉄 / トランスポーター / 膜タンパク質 / 鉄錯体 / 植物 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
現在、陸地の約1/3は石灰質土壌と呼ばれる耕作に適さない不良土壌である。この石灰質土壌では鉄は難溶性の三価鉄として存在し、植物の成長を著しく阻害する。ムギやトウモロコシは、根からムギネ酸と呼ばれる物質を排出し石灰質土壌での三価鉄の吸収を可能としている。ムギネ酸は新たな肥料として注目されており、より安価で安定な類似化合物も開発されている。ムギネ酸による鉄の吸収はYS1と呼ばれる膜輸送体が担っている。本研究ではクライオ電子顕微鏡法を用いてどのようにYS1がムギネ酸鉄を認識し輸送するのかについて明らかにするとともに、より効率的で安価・安定なムギネ酸類似化合物の開発につなげることを目的とする。
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| 研究実績の概要 |
今年度は、脂質環境下におけるYS1の内向き開口構造への構造変化の解析を目指して、YS1のナノディスクへの再構築を行なった。大豆由来の脂質に10%の割合でコレステロールを加えた混合脂質と、MSP（membrane scaffold protein）としてMSP2N2を用いてナノディスクへの再構築を行なった。サイズ排除クロマトグラフィーによってYS1二量体を内包したナノディスクを回収した。そのナノディスクに、基質としてムギネ酸鉄を加え、さらに pH を pH=6.5 に下げて内向き開口構造への構造変化を促した。その試料をグリッドに凍結し、横浜理研に設置されている加速電圧 300 kV のクライオ透過電子顕微鏡を用いて、測約5000枚のマイクログラフを収集した。ソフトウェア cryoSPARC を用いて約3Å分解能でクライオ電子顕微鏡マップを再構築に成功した。しかし、得られた構造は従来の外向き開口構造であり、主鎖レベルではほとんど違いが見られなかった。
次年度以降への新規の研究プロジェクトとして、新たにシナプス小胞膜に局在する膜輸送体ホモログであるSV2Aの研究を開始した。SV2Aは、生理的な機能は未知であるが、ボツリヌス毒素と抗てんかん薬の受容体であることから医学的な見地から重要な標的である。昆虫細胞を用いてSV2Aを精製し、ボツリヌス毒素の受容体結合部位と抗てんかん薬であるレベチラセタム及びブリバラセタムとの複合体の構造をクライオ電子顕微鏡を用いて決定した。その結果、ボツリヌス毒素がタンパク質間相互作用に加えてSV2Aの糖鎖を認識している機構を明らかにするとともに、ブリバラセタムがレベチラセタムより高い結合親和性を持つことをアミノ酸残基レベルで明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初の予定であったナノディスクに再構成したYS1の構造解析に成功した。しかし、期待していた内向き開口構造を得ることはできなかった。今後、リポソームへの再構成など違ったアプローチも含めて、さらなる工夫が必要がある。一方、新たな研究プロジェクトとして、SV2Aによるボツリヌス毒素および抗てんかん薬の認識機構の解明を開始した。SV2Aとボツリヌス毒素受容体結合部位および抗てんかん薬との複合体の構造をクライオ電子顕微鏡を用いて決定した。これは当初の計画に含まれていなかったが、当初の予定を大きく上回る結果を得ている。以上より当初の計画以上に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
YS1の内向き開口構造の解析に向けて、さらにpHを下げた条件でのデータ測定を行うとともに、リポソームへの再構成に挑戦する。さらに、内向き開口構造のモデルを基に、内向き開口構造を固定化するようなシステイン残基導入変異体の作製を内向き開口構造を固定化できるような変異体の作製を行う。ナノディスク再構成と内向き開口構造に固定化できる変異体を組み合わせた構造解析にも挑戦する予定である。
SV2Aに関しては、全長のボツリヌス毒素との複合体の構造解析を目指す。SV2Aが存在する神経細胞膜を反映した脂質組成のナノディスクに再構成し、無毒化全長ボツリヌス毒素との複合体との構造解析を目指す。
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