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哺乳類 ERAD における逆輸送機構の包括的理解

研究課題

研究課題/領域番号 23K23840
補助金の研究課題番号 22H02576 (2022-2023)
研究種目

基盤研究(B)

配分区分基金 (2024)
補助金 (2022-2023)
応募区分一般
審査区分 小区分43030:機能生物化学関連
研究機関関西学院大学

研究代表者

沖米田 司  関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (90398248)

研究分担者 高橋 宏隆  愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (70432804)
福田 亮介  関西学院大学, 生命環境学部, 助教 (90825308)
研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2024年度)
配分額 *注記
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2024年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2023年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 8,580千円 (直接経費: 6,600千円、間接経費: 1,980千円)
キーワードERAD / 逆輸送 / タンパク質品質管理 / ユビキチンリガーゼ / retrotranslocation / 小胞体品質管理 / 膜タンパク質 / ユビキチン
研究開始時の研究の概要

ユビキチンE3リガーゼ RNF5/RNF185経路以外の重要な逆輸送およびERAD責任分子を特定するために、RNF5/185二重欠損細胞での候補分子の機能阻害実験を行い、CFTR変異体や様々なERAD基質への影響を明らかにする。また、細胞内およびin vitroでの結合解析により、ERAD関連分子、特にユビキチンE3リガーゼが認識する分解基質の最小単位を特定する。さらに、E3リガーゼ結合領域を含む膜タンパク質の逆輸送およびERADにおけるユビキチンE3リガーゼ阻害効果を調査し、ユビキチンE3リガーゼの基質選択性の分子メカニズムを明らかにする。

研究実績の概要

A-1. 新規ERADモデル基質の構築と分解機構の解明:ERAD-M基質Insig-1,ERAD-C基質ABCB1のERADをリアルタイムに追跡するHiBiT assayを確立した.また,Insig-1については,HiBiT tagの位置を小胞体内腔に変えることで,そのretrotranslocationのリアルタイム定量が可能となった.
A-2. 多重機能阻害実験による逆輸送関連分子の作用点解明: RNF5/RNF185二重欠損細胞を用いた解析により,細胞質のHECT型E3 ligase UBE3CおよびHERC3がRNF5/185経路とは独立してCFTR変異体のERADを促進することを明らかにした.本研究成果は,国際誌Cells (DOI: 10.3390/cells12232741)およびJ Cell Biol (DOI: 10.1083/jcb.202308003) に受理された.さらに,多様なERADモデル基質を用いた解析により,RNF5, RNF185, HERC3はERAD-C基質 (CFTR, ABCB1) のretrotranslocationおよびERADを選択的に促進することを明らかにした.
B-1. NanoBiT法による逆輸送分子の基質結合解析: NanoBiT法により,CFTR変異体との結合に関わるRNF185内の相互作用領域の候補を見出した.今後,精製タンパク質を用いたin vitro結合解析により,直接的な結合について解析する予定である.
C-1. プロテオリポソームを用いた逆輸送機構の解析: 無細胞合成系により,CFTR含有プロテオリポソームの調製に成功した.AlphaScreenによる結合実験の結果,HERC3はリポソーム中のCFTR膜貫通領域と結合しないが,リポソーム外に出ると結合することを見出した.従って,HERC3は膜から露出したCFTR膜貫通領域を認識すると考えられる.

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ほぼ予定通りに研究成果が得られており,UBE3CとHERC3に関する知見については,2報の査読付き原著論文(Kamada et al, Cells 2024 & Kamada et al, J Cell Biol 2024)として受理されたため.

今後の研究の推進方策

1. 無細胞タンパク質合成系と共に,大腸菌タンパク質発現系を用いたin vitro結合実験も進め,逆輸送関連分子とERADモデル基質との相互作用機構を明らかにする.
2. 新たに確立したTCRalpha-TM-HiBiTキメラ分子を用いたERADリアルタイム定量解析により,逆輸送分子が認識する最小配列(デグロン)に起因するERAD促進効果が,逆輸送分子機能阻害で抑制されるか否かを明らかにする.本解析により,逆輸送分子によるERAD制御の基質選択性について知見を得る.
3. RNF5/RNF185二重欠損細胞で発現増加したE3リガーゼの機能解析も進め,論文発表まで進める.

報告書

(2件)
  • 2023 実績報告書
  • 2022 実績報告書
  • 研究成果

    (15件)

すべて 2024 2023 2022 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 1件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 1件、 招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [国際共同研究] マギル大学(カナダ)

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [雑誌論文] Ligand-based virtual-screening identified a novel CFTR ligand which improves the defective cell surface expression of misfolded ABC transporters2024

    • 著者名/発表者名
      Taniguchi Shogo、Berenger Francois、Doi Yukako、Mimura Ayana、Yamanishi Yoshihiro、Okiyoneda Tsukasa
    • 雑誌名

      Frontiers in Pharmacology

      巻: 15

    • DOI

      10.3389/fphar.2024.1370676

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] HERC3 facilitates ERAD of select membrane proteins by recognizing membrane-spanning domains2024

    • 著者名/発表者名
      Yuka Kamada, Yuko Ohnishi, Chikako Nakashima, Aika Fujii, Mana Terakawa, Ikuto Hamano, Uta Nakayamada, Saori Katoh, Noriaki Hirata, Hazuki Tateishi, Ryosuke Fukuda, Hirotaka Takahashi, Gergely L. Lukacs, Tsukasa Okiyoneda
    • 雑誌名

      Journal of Cell Biology

      巻: 223(7) 号: 7

    • DOI

      10.1083/jcb.202308003

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] The multiple ubiquitination mechanisms in CFTR peripheral quality control2023

    • 著者名/発表者名
      Taniguchi Shogo、Fukuda Ryosuke、Okiyoneda Tsukasa
    • 雑誌名

      Biochemical Society Transactions

      巻: 51 号: 3 ページ: 1297-1306

    • DOI

      10.1042/bst20221468

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Identification of α-Tocopherol succinate as an RFFL-substrate interaction inhibitor inducing peripheral CFTR stabilization and apoptosis2023

    • 著者名/発表者名
      Taniguchi Sachiho、Ono Yuji、Doi Yukako、Taniguchi Shogo、Matsuura Yuta、Iwasaki Ayuka、Hirata Noriaki、Fukuda Ryosuke、Inoue Keitaro、Yamaguchi Miho、Tashiro Anju、Egami Daichi、Aoki Shunsuke、Kondoh Yasumitsu、Honda Kaori、Osada Hiroyuki、Kumeta Hiroyuki、Saio Tomohide、Okiyoneda Tsukasa
    • 雑誌名

      Biochemical Pharmacology

      巻: 215 ページ: 115730-115730

    • DOI

      10.1016/j.bcp.2023.115730

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] UBE3C Facilitates the ER-Associated and Peripheral Degradation of Misfolded CFTR2023

    • 著者名/発表者名
      Kamada Yuka、Tateishi Hazuki、Nakayamada Uta、Hinata Daichi、Iwasaki Ayuka、Zhu Jingxin、Fukuda Ryosuke、Okiyoneda Tsukasa
    • 雑誌名

      Cells

      巻: 12 号: 23 ページ: 2741-2741

    • DOI

      10.3390/cells12232741

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] CFTRの小胞体関連分解を制御する膜貫通デグロンの探索2024

    • 著者名/発表者名
      沖米田 司
    • 学会等名
      ユビキチン研究会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 翻訳後修飾による膜タンパク質CFTRの品質管理2023

    • 著者名/発表者名
      沖米田 司
    • 学会等名
      第 96 回日本生化学会大会 シンポジウム "分泌経路の新しいタンパク質輸送・修飾システム”
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 小胞体関連分解を標的とした嚢胞性線維症の治療法開発2023

    • 著者名/発表者名
      鎌田 優香, 松浦 佑大, 谷口 幸穂, 西井 一真, 中山田 詠, 立石 葉月, 日向 大智, 福田 亮介, 川谷 誠, 本田 香織, 長田 裕之, 沖米田 司
    • 学会等名
      第46回日本分子生物学会年会 シンポジウム 2PS-06 アカデミア創薬
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] sgRNAゲノムワイドスクリーニングによる新規CFTR品質管理分子の同定2023

    • 著者名/発表者名
      谷口 正伍, 三村 文菜, 福田 亮介, 木塚 康彦, 沖米田 司
    • 学会等名
      第46回日本分子生物学会年会 シンポジウム2PS-17 遅延制御による脳機能障害および神経変性疾患の理解
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 小胞体関連ユビキチン E3 リガーゼ Gp78 と Hrd1 の阻害剤探索2023

    • 著者名/発表者名
      平田 規晃,川谷 誠、本田 香織、長田 裕之、福田 亮介、沖米田 司
    • 学会等名
      第46回日本分子生物学会年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] A HECT type E3 ligase facilitates the ERAD of aberrant membrane proteins by recruiting UBQLN2022

    • 著者名/発表者名
      Yuka Kamada, Aika Fujii, Ikuto Hamano, Ryosuke Fukuda, Tsukasa Okiyoneda
    • 学会等名
      The International Symposium in Tokyo 2022. Ubiquitin New Frontier“ from Neo-Biology to Targeted Protein Degradation”
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] CFTR 変異体の小胞体関連分解におけるバイパス機構の解明2022

    • 著者名/発表者名
      藤井 愛日, 鎌田 優香, 福田 亮介, 沖米田 司
    • 学会等名
      第95回日本生化学学会大会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] HECT 型 E3 リガーゼは UBQLN を動員して異常膜タンパク質の小胞体関連分解を促進する2022

    • 著者名/発表者名
      鎌田優香、藤井愛日、中島千雅子、大西裕子、寺川真奈、濱野伊玖斗、福田亮介、沖米田司
    • 学会等名
      第45回日本分子生物学会年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [備考] 沖米田研究室 HP

    • URL

      https://okilabkgu.wixsite.com/okilab2013

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書 2022 実績報告書

URL: 

公開日: 2022-04-19   更新日: 2024-12-25  

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