| 研究課題/領域番号 |
23K23857
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02594 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43040:生物物理学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
加藤 昌人 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 上席研究員 (30867768)
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| 研究分担者 |
藤井 健太郎 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, チームリーダー (00360404)
中川 洋 国立研究開発法人日本原子力研究開発機構, 原子力科学研究部門 原子力科学研究所 物質科学研究センター, 研究主幹 (20379598)
中林 孝和 東北大学, 薬学研究科, 教授 (30311195)
松尾 龍人 広島国際大学, 保健医療学部, 准教授 (60623907)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2024年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
2023年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
2022年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
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| キーワード | 液‐液相分離 / low-complexity domain / cross-b fiber / 神経変性疾患変異 / 液－液相分離 / CD / ラマン顕微鏡 / 中性子散乱 / クロスβ構造 / low-complexityドメイン / 相分離 / ALS変異体 / low-complexity sequence / 放射光CD / ラマンスペクトル / 相分離液滴 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞内には、膜で仕切られた小器官（ミトコンドリアや小胞体）とは別に、タンパク質や核酸が凝集して形成された膜の仕切りを持たない柔らかい構造体も多数存在する。その形成は、水と油が混ざらずに液滴のように分離するのとよく似た機構（液‐液相分離）によって起こることがわかってきたが、まだ分子レベルでのメカニズムについては研究過程である。本研究では、相分離液滴に物理的に接触しない光を用いた計測方法を中心に研究する。
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| 研究実績の概要 |
加藤グループは、FUS LCDの野生体とALS変異体deltaS57、deltaG174G175を精製し、塩やバッファー成分を含まない濃縮溶液条件から、他のグループの測定条件に最適なバッファー条件下で、温度降下によって相分離液滴を形成させる条件検討し、その系を確立した。そしてそのサンプルを各グループに提供した。
中川グループは、加藤グループから提供された、36℃から5℃に温度を下げると相分離をするFUS LCD試料について、日本原子力研究開発機構のJRR-3原子炉に設置されてある中性子小角散乱装置で測定を行った。その結果、液滴形成により野生型では慣性半径が変化する一方で、変異体では変化しない傾向が見られた。今後はシグナルの精度を上げるため、試料の濃度を上げることで再度実験を実施する予定である。
藤井グループでは、溶液試料の温度を室温から10℃程度に降温することで、液液相分離を示すFUS LCD試料について、放射光VUV-CDスペクトルの測定を継続して行っている。これまでに温度変化によるCDスペクトル強度の変化を観測したものの、相分離に伴う構造変化によるものかどうかについては判明していない。今後は試料純度の向上を目指したうえでCDスペクトルの測定を実施する予定である。
中林グループでは、ラマンおよび自家蛍光顕微鏡を用いたラベルフリーでの液滴構造解析を検討した。ラマンイメージングについては、FUS LCDおよびその変異体、さらにFUS全長の単一液滴状態でのラマン測定に成功した。温度コントロールによって作成したFUS LCの液滴は、変異によるラマンスペクトルの変化は観測されず、液滴内のタンパク質の二次構造に顕著な違いが無いことがわかった。自家蛍光については、紫外励起自家蛍光寿命顕微鏡を製作し、FUS LCD内のチロシンを用いて自家蛍光寿命および異方性測定が行えることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
加藤グループ:野生体と変異体試料を各グループの測定条件に最適化できる状態で提供することができたため。
中川グループ：温調によってFUS LCD試料の液液相分離を制御するための中性子小角散乱装置の試料環境を整え、野生型と変異体の構造変化を検出したため。
藤井グループ：試料溶液中にわずかに残留している塩素などの影響によりCDスペクトルのバックグラウンドが190nm付近で増加したが、全体的には良好なスペクトルを得ることができたため。
中林グループ：ラマンおよび自家蛍光寿命顕微システムを用いて、単一液滴の構造の詳細、時間変化を追跡できる状況が整備されたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
加藤グループ：高速AFMを用いて、FUS LCDやTDP-43 LCDのモノマー分子の動態を撮影する。複数のモノマー分子の衝突・液滴核形成を撮影するための条件検討をする。
中川グループ：高濃度での試料を用いて中性子小角散乱実験を実施する。ギニエ解析による慣性半径を指標とした解析などを行い、液滴形成による構造変化や変異による構造状態の違いを解析する。
藤井グループ：試料高純度試料のCDスペクトルの測定を行うとともに、同時に測定した吸収強度からの試料濃度の校正から精確なCDスペクトル解析を行う。その後、試料作製後の経時的な変化を追跡することで、繊維状態の蓄積に関する情報を得る予定である。
中林グループ：液滴から凝集体への時間変化についてラマンおよび自家蛍光顕微鏡を用いて測定する。構造変化ダイナミクスの変異依存性等から、液滴から凝集体への時間変化過程の詳細を明らかにする。さらにRNAの有無による液滴内のタンパク質構造、構成成分、時間変化の違いについて、ラマン顕微鏡から検討する。
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