| 研究課題/領域番号 |
23K23886
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02623 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分44010:細胞生物学関連
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
木梨 達雄 関西医科大学, 医学部, 学長 (30202039)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2024年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2023年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
2022年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
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| キーワード | cell adhesion / integrins / Rap1 / talin / kindlin3 / 細胞接着 / インテグリン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
インテグリンは細胞接着を可塑的に制御することによって細胞外環境との相互作用を変化させ、細胞形態、細胞移動や機能、増殖等に重要なシグナル伝達を行う。インテグリンを介するinside-out/outside-inの双方向性シグナル伝達によって発生する少数の高親和性結合と低親和性結合によって細胞接着の可塑性および堅牢性が誘導されるメカニズムを明らかにする。そのため、Rap1によるインテグリン結合分子talin1, kindlin-3の制御を中心に、弱い接着であるローリング過程から安定した接着、およびケモカインによる細胞移動などの生理的過程に生じるインテグリン接着制御を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
（１）インテグリンを調節する分子間の細胞内結合動態と接着誘導の解明：
細胞外LFA1と細胞内α4β1, α4β7, αIIbβ3 のキメラ分子を作成・BAF細胞に導入後、結合過程の一分子イメージングによる結合動態解析を行った。高親和性細胞外LFA1をmAb24で誘導し細胞内領域（CT）をβ2からβ1,β7に置換したキメラ分子とtalin1との結合はβ7がもっとも弱く、β2がもっとも強いことが明らかになった。
（２）ローリング、一過性停止(tether)、安定した停止(arrest)の動態変化をする実験系を用いて、遺伝子欠損T細胞の解析からtalin1、kindlin3、Rap1a/Rap1b、Rap1活性化因子 (RasGRP2, C3G)がCCL21による停止に必須であった。Rap1 affinity probe, halotag-talin1 knock-inマウス由来T細胞を用い、潅流下のキャプチャーからRap1が活性化し、遺伝子欠損T細胞の解析から, ローリングの安定化（速度低下）にはRap1、talin1が必要であるが、kindlin-3は必要ないこと、停止接着にはRap1, talin1, kindlin-3が必要であることが明らかになった。
（３）細胞極性および細胞接着・移動の制御過程を明らかにする。
前年度の解析結果から接着非依存性のCCL21によるT細胞の細胞極性をimaging cytometryおよびAIによる数万の画像解析の自動化によってRap1依存性を同定した。さらにRap1はDOCK2/Racによるアクチン骨格の成長(pseudopod)に依存してC3G/RasGRP2が活性しRap1の活性化を誘導することが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでtalinとインテグリンの細胞内領域の動態を計測する手段はなかったが、一分子計測によって細胞内talin結合動態解析が可能となり、talinと会合頻度および結合時間が計測可能となった。さらに、αLβ2(LFA1)のαL鎖およびβ2鎖の細胞内領域を他のβ1, β3, β7インテグリンの細胞内領に置換し細胞に発現させ、抗体もしくはMn2+による高親和性LFA1を誘導した際のtalin1結合動態測定系を樹立し、talin1の結合動態が実測できるようになった。β2鎖がもっとも強くtalin1に結合をしたことから、今後その原因を追究することが求められる。
また、この結果はL-selectin/PNAdおよびLFA1/ICAM1による白血球接着カスケードとα4β7/MAdCAM1によるそれとの比較をする際に重要な知見をもたらした。特に後者のローリングはRap1、talin1が必要ではなく、おそらく構造的な柔軟性によりα4β7単独でローリングを行い、停止のときにtalin1が関与する。一方、LFA1/ICAM1によるローリングにはtalin1の結合が必要であることから、talin1と細胞内領域との結合親和性が調節の鍵になっていることが示唆される。リンパ球細胞極性におけるRap1の必要性についてはAIによる判定系が樹立でき、定量的に形態計測が可能になったことから、Rap1の上流シグナルの評価が明確にできるようになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
およそ計画通りに進める予定である。β7とβ2の部分キメラを作成し、結合力の差が生じている領域を同定する。また、talin1の結合部位についてpull-down アッセイなどを用いて同定する。Rap1 affinity probe, halotag-talin1 knock-inマウス由来T細胞を用い、潅流下のリンパ球のキャプチャーからローリング、停止接着に至る過程でRap1活性化およびtalin1の膜への集積のタイミングを明らかにする。リンパ球細胞極性についてはtalin1, kindlin-3, RIAM欠損T細胞、およびhalotag-talin1 knock-in T細胞を用いて、インテグリン非依存性の細胞極性誘導のメカニズムを明らかにする。
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