| 研究課題/領域番号 |
23K24016
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02753 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47020:薬系分析および物理化学関連
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
浅井 知浩 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (00381731)
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| 研究分担者 |
池田 潔 静岡県立大学, 薬学部, 客員教授 (40168125)
米澤 正 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (50469988)
小出 裕之 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (60729177)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2024年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2022年度: 8,580千円 (直接経費: 6,600千円、間接経費: 1,980千円)
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| キーワード | 脂質ナノ粒子 / mRNA / 抗原提示細胞 / ワクチン / drug delivery system |
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| 研究開始時の研究の概要 |
脂質ナノ粒子（LNP）技術を用いたmRNAワクチンの承認を契機に、感染症のみならず様々な非感染性疾患に対するmRNAワクチン／治療薬の開発が進展すると期待されている。LNP技術は、mRNAワクチンの安定性、体内動態、導入効率、および効果を決定付ける重要な製剤技術である。本研究では、mRNAの導入法の確立が待たれている抗原提示細胞を標的とした新規LNP技術を開発し、個別化がん免疫療法への応用可能性を探求する。抗原提示細胞の物質輸送システムに着目した独創的なmRNAデリバリーシステムを構築し、独自のLNP技術を用いた画期的ながんワクチンの開発を目指した研究を展開する。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、これまでに我々が開発したLNP技術を基盤にし、CD169陽性の抗原提示細胞を標的としたmRNAデリバリーシステムに関する研究を行っている。本年度はCD169に結合性を示すα2,3-シアル酸を表面に提示したmRNA/LNP製剤の開発を試みた。pH応答性脂質、リン脂質、マレイミド脂質、コレステロールからなる混合脂質を溶解したエタノール溶液とmRNAを含むクエン酸水溶液をマイクロ流路内で急速混合した後、エタノールを除去してLNPを調製した。このLNP溶液にα2,3-シアル酸誘導体を添加し、マイケル付加反応によってα2,3-シアル酸修飾LNPを調製した。HPLC分析の結果、α2,3-シアル酸誘導体が高効率にLNPに結合したことが示された。一方、上記と同様の方法でマレイミド脂質を含有しないLNPを調製した後、α2,3-シアル酸構造をもつガングリオシドGM3を添加し、GM3修飾LNPを作成した。各リガンド修飾LNPがCD169陽性抗原提示細胞に対してターゲティング能を有するか検討するため、IFN-αで刺激したマウス骨髄由来マクロファージ（BMDM）を用いた実験を行った。IFN-αで刺激したBMDM のCD169発現についてフローサイトメトリーで解析したところ、刺激によってCD169の発現が亢進することが明らかになった。各リガンド修飾LNPのmRNA送達効率について検討するため、Cy5標識mRNAを封入したLNPを作成し、IFN-α刺激BMDMに添加した。GM3修飾LNP添加群ではCy5標識mRNAの細胞内取り込みが増加したが、α2,3-シアル酸修飾LNPでは増加しなかった。LNP表面上のα2,3-シアル酸構造がCD169陽性抗原提示細胞に認識されるためには、脂質誘導体のα2,3-シアル酸以外の構造も重要であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、新規に設計・合成したα2,3-シアル酸誘導体あるいは市販のガングリオシドGM3を修飾した標的化mRNA/LNP製剤の調製方法について検討した。その結果、これまでに各リガンド修飾LNP（GM3修飾LNP、α2,3-シアル酸修飾LNP）の調製が可能になった。またIFN-αによる刺激でマウス骨髄由来マクロファージのCD169発現が亢進することを示し、CD169標的化LNPのインビトロにおける評価系を構築した。蛍光色素Cy5で標識したmRNAを用いた細胞内取り込み実験によってα2,3-シアル酸修飾LNP とGM3修飾LNPのCD169標的化能を比較したところ、α2,3-シアル酸誘導体の構造最適化の必要性が示唆された。今年度はα2,3-シアル酸誘導体の再設計と合成が必要になったこと以外はほぼ計画通りに進んでおり、全体としてはおおむね順調に推移していると考えている。今後はα2,3-シアル酸誘導体の構造最適化検討を行い、CD169陽性抗原提示細胞選択的なmRNA/LNP製剤の開発を進める。
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| 今後の研究の推進方策 |
CD169陽性抗原提示細胞にmRNAを選択的に送達させることを目的とし、CD169に結合性を示すα2,3-シアル酸を修飾したLNPの開発を継続する。これまでの知見を基にしてα 2,3-シアル酸の脂質誘導体の構造を改変し、その誘導体をLNP表面に修飾することでCD169陽性抗原提示細胞への標的化を試みる。新たに作成したα2,3-シアル酸修飾LNP とGM3修飾LNP を用い、CD169陽性マクロファージにCy5標識mRNAを導入し、各LNPの標的化能を比較検討する。次に、モデル抗原卵白アルブミン（OVA）に対するmRNAを封入したLNPを調製し、免疫応答に関する動物試験を実施する。mRNA/LNP製剤をC57BL/6マウスに投与後、細胞傷害性T 細胞の活性化および抗体誘導能について評価し、LNPの性能をインビボで明らかにする。またマウス胸腺腫細胞EL4由来のOVA抗原強制発現株EG7を用い、LNPのがんワクチン開発における有用性について検討を行う。EG7細胞を皮下移植して作成した担がんマウスにOVA mRNAを封入したLNPを投与し、その抗腫瘍効果を明らかにする。本研究で開発するLNP技術を用いたmRNAワクチンの有効性に関してProof of Conceptの取得を目指す。
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