組織関門透過ペプチドの輸送分子機序解明に基づくマクロトランスサイトーシスの同定

• 研究課題/領域番号: 23K24048
• 補助金の研究課題番号: 22H02786 (2022-2023)
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 基金 (2024); 補助金 (2022-2023)
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分47060:医療薬学関連
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 伊藤 慎悟 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (20466535)
• 研究分担者: 大槻 純男 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (60323036)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円); 2025年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2024年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円); 2023年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円); 2022年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
• キーワード: 細胞膜透過ペプチド / 組織関門 / マクロピノサイトーシス / トランスサイトーシス / ドラックデリバリーシステム

研究開始時の研究の概要

バイオ医薬やナノ粒子等の経口吸収や脳内送達を実現する新しい輸送機序を介した組織関門透過技術が世界中から待望されている。本研究の目的は、応募者が独自に見出した「組織関門透過ペプチド」の輸送分子機序解明に基づくマクロトランスサイトーシスの同定である。達成によって、組織関門における新たな生体高分子化合物の輸送システム解明と組織関門透過技術開発の突破口を開くことが期待される。

研究実績の概要

織透過ペプチドであるDNPペプチドのマクロトランスサイトーシス輸送に関与する分子候補について、レンチウイルスを用いた分子XのノックダウンCaco-2細胞を構築した。Transwellを用いた経細胞輸送実験を行った結果、分子XノックダウンCaco-2細胞においてDNPペプチドの輸送が有意に低下した。昨年度の取り込み実験の結果と統合すると、DNPペプチドは分子Xを介して小腸上皮を透過することが示唆された。In vivoマウスモデルにおいて、抗分子X抗体を用いた阻害実験から、DNPペプチドを用いたインスリンの小腸吸収が抗分子X抗体の存在によって低下し、それによるインスリンの血糖降下作用も低下した。これらの結果から、DNPペプチドの小腸吸収は分子Xを介して行われることが示唆された。
分子Xの知見をもとに、BBB透過環状ペプチドであるSLSペプチドのマクロトランスサイトーシスに関与する分子をBBBプロテオーム解析データから推定したところ、分子Yが候補として挙がった。shRNAを用いて分子Yを安定的にノックダウンしたBBBモデル細胞の構築を行い、この構築した分子YノックダウンBBBモデル細胞を用いてSLSペプチドの輸送解析を行った。その結果、SLSペプチドのBBBモデル細胞への取り込みは有意に低下した。また、分子Yのリコンビナントタンパク質を作成し、SLSペプチドと分子Yの結合実験を定性的に行ったところ、SLSペプチドは分子Yに結合することが確認された。以上の結果から、SLSペプチドの輸送に分子Yが関与することが示唆された。一方で、分子YだけではBBBにおけるSLSペプチドの輸送を説明することは難しいことも判明し、SLSペプチドのマクロトランスサイトーシスの解明には新たな分子を同定することが必要であることも示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

DNPペプチドおよびSLSペプチドの輸送分子を同定できてきていることから、本研究は概ね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

本年度は、小腸透過環状ペプチドDNP (DNPペプチド) について、(計画3)組織関門透過ペプチド細胞内内在化分子の輸送特性解析と(計画4)　組織関門透過ペプチド輸送分子の発現量・局在解析を実施する。一方、血液脳関門透過環状ペプチドSLS　（SLSペプチド）について、(計画1)　組織関門透過ペプチドの細胞内内在化に関わる分子の探索と　(計画2)　組織関門透過ペプチド細胞内内在化分子の同定を実施する。
具体的には、同定分子が既知のマクロトランスサイトーシスを惹起するかをEIPAを含む既知のマクロトランスサイトーシス阻害剤およびマクロピノサイトーシス解析で汎用される蛍光標識70kDaデキストランの細胞内取り込み実験によって検討する。また、阻害実験から想定されるマクロトランスサイトーシスに関わる分子を遺伝子ノックダウンし、その寄与を解析する。さらに、培養細胞やマウス組織、ヒト組織における同定分子の発現局在を免疫組織化学的解析によって解析し、その発現量を定量プロテオーム解析を用いて行う。一方、血液脳関門透過環状ペプチドSLS　（SLSペプチド）について、(計画1)　組織関門透過ペプチドの細胞内内在化に関わる分子の探索と　(計画2)　組織関門透過ペプチド細胞内内在化分子の同定を実施する。まず、SLSペプドのマクロトランスサイトーシスにおいて細胞内内在化に関わる分子を同定するために、遺伝子ノックアウト細胞ライブラリーと細胞取り込み解析を組み合わせた同定戦略を実施する。次に、細胞内内在化分子の同定を次世代シークエンサー解析によって実施する。一方で、これまでにSLSペプチドのマクロトランスサイトーシス輸送に関わる分子候補が挙がっており、その分子の関与について発現細胞やノックダウン細胞を構築し、細胞内内在化への関与を解析する。