| 研究課題/領域番号 |
23K24062
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02800 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分48020:生理学関連
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
三木 隆司 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (50302568)
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| 研究分担者 |
波多野 亮 千葉大学, 大学院医学研究院, 助教 (60521713)
李 恩瑛 千葉大学, 災害治療学研究所, 准教授 (60583424)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2025年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2024年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2023年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
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| キーワード | 胆汁酸 / マルチオミクス解析 / 脂肪肝 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
脂肪肝は、より重症な脂肪性肝炎、肝硬変、肝癌へと進展する可能性を有する病態である。従って、その病態解明は急務であるが、未だ有効な治療法はない。申請者らはこれまでの解析から、正常な脂肪組織をインスリン抵抗性マウスに移植すると、抵抗性が改善し、血中の特定胆汁酸(TIBA)濃度が増加することを発見した。さらに野生型マウスにTIBAを投与すると、高脂肪食負荷による脂肪肝が著明に改善した。そこで本研究では、様々な解析を統合してTIBAが脂肪肝を改善させる分子メカニズムを解明し、脂肪肝の新規治療法開発に資する学術基盤を構築する。
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| 研究実績の概要 |
我々は、特定の胆汁酸TIBAが高脂肪食負荷による脂肪肝発症を強力に抑制することを見出し、本研究でその分子機構の解明と脂肪肝の新たな治療標的としてのTIBAの有用性を検証することを目指している。令和4年度には、TIBAがPPARαを活性化する分子機構を解明する目的で、初代培養肝細胞にTIBAを処理し、TIBAを投与したマウスの肝臓で見られたPPARαの標的分子群の発現誘導を調べた。しかし、TIBAの濃度や処理時間などの実験条件を変えても、PPARαの標的遺伝子は全く発現誘導されなかった。効果発現にはTIBAの長期投与が必要である可能性を考え、初代培養肝細胞ではなくTIBA長期投与が可能な肝細胞株であるAML12細胞を用い、TIBAで長期処置した細胞を用いてPPARαの標的遺伝子の遺伝子発現量を定量解析したがやはりPPARαシグナル活性化は見られなかった。同様に初代培養肝細胞にTIBAを処理し、フラックスアナライザーで細胞代謝を測定してもTIBAの効果は見られなかった。
しかし興味深いことに、マウス個体レベルでTIBAを長期間投与したのち、初代培養肝細胞を単離し、細胞代謝を測定したところ、TIBAにより有意な脂肪酸酸化の亢進と酸素消費の増加がみられた。このことから、TIBAの効果は肝細胞への直接効果ではなく、①肝臓以外の標的臓器に作用し、二次的に肝臓に作用し脂肪肝の発症が抑制されている可能性と、②肝臓内の肝細胞以外の細胞タイプに作用し、間接的に肝細胞に作用して細胞内の脂肪蓄積が減少している可能性も考慮する必要があることが明らかになった。その際疑われる、肝臓以外の標的臓器としては、TIBAが直接作用する可能性がある腸内細菌叢、腸内皮細胞（特に胆汁酸受容体が豊富な回腸末端）、脂肪組織の関与が疑われた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和4年には計画通り、肝細胞でTIBAがPPARαを活性化する分子機構の解明を目指した。しかしin vitroで初代培養肝細胞と肝細胞株のAML12細胞にTIBAを処置しても、マウス個体へのTIBA投与時にみられる肝臓でのPPARαシグナル活性化は見られなかった。TIBAが肝細胞ではなく、それ以外の臓器あるいは肝臓内の肝細胞以外の細胞に作用する可能性が示唆された。
そこで当初の計画を変更し、申請時に「課題3」として提案した臓器間ネットワークの解析を先に検討することにした。特にTIBA長期投与後に肝臓での炎症シグナルが変化することが新たに判明し、腸内細菌叢と腸管へのTIBAの作用の解析を優先することにした。ところが同実験を、共同研究として日本と英国で行っていたところ、両施設での解析結果が異なることが判明し、マウス飼育施設間の腸管細菌叢の違いによると考えられた。さらに腸内細菌叢の影響を排除するために、in vitroで肝細胞にTIBAを添加しても細胞代謝にも変化は見られなかったことから、腸内細菌叢を含め、個体レベルでの作用が疑われた。このことから、異なる飼育環境でのデータの再現性を確認する必要がでた。幸い、令和5年度に新規マウス飼育施設で実験を行うことが可能となり、施設準備ができてから再度実験を行うことになった。
しかし実験結果は予想外であったが、TIBAが肝細胞ではなく、その他の臓器、細胞、あるいは腸内細菌叢に作用し、間接的に肝細胞での脂肪蓄積が抑制される可能性が強く示唆されたことは非常に大きな発見であり、令和5年度以降に肝細胞以外のTIBAの採用標的細胞を同定し、その分子機構を解明する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記の通り、肝細胞へのTIBAの作用をin vitroで解析する目的で、マウスから単離した初代培養肝細胞にTIBAを処置して、細胞内脂肪蓄積や細胞内シグナルや細胞機能を解析した。しかしながら、この解析ではマウス個体レベルで見られたTIBAの脂肪肝抑制効果は再現できなかった。この原因として、TIBAが肝臓以外あるいは肝細胞以外に作用し、間接的に肝細胞での代謝を変化させる可能性を考え下記の研究を行う。
＜課題１＞TIBAの肝臓以外に作用する可能性の検証：これまでの結果からTIBAが肝臓以外の臓器に作用する可能性が示唆されたため、TIBAが回腸に作用し、腸上皮細胞由来のFgf15などを介して脂肪肝を抑制する可能性を検証する。この目的で、TIBAを処置した回腸の遺伝子発現をRNAseq解析し、FXRを含む複数の核内受容体の下流シグナルをトランスクリプトームから解析する。
一方、TIBAが腸内細菌叢の構成を変化させ、腸内細菌叢の代謝産物あるいは腸内細菌叢による免疫応答などの変化を介してTIBAが脂肪肝の発症を抑制している可能性もあり、TIBA処置後の腸内細菌叢の変化を16Sシークエンス解析により検討する。
＜課題2＞TIBAが肝臓の肝細胞以外の細胞に作用する可能性の検証：TIBAがin vitroで肝細胞に脂肪肝抑制効果Tを示さない原因として、肝臓以外にTIBAが作用する可能性に加え、肝臓内の肝細胞以外の細胞に作用している可能性も考えられ、クッパー細胞、星細胞、NKT細胞などの免疫細胞の関与も疑われる。そこで、in vivoでTIBA処理をしたマウス肝臓から肝細胞以外の細胞種を濃縮し、シングルセル解析を行い、TIBAの標的細胞とその分子標的を解明する。
これらの解析により、TIBAの高脂肪食負荷時の脂肪肝発症の抑制機序が解明され、脂肪肝の新規治療法の開発につながることを目指す。
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