| 研究課題/領域番号 |
23K24211
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02950 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分51030:病態神経科学関連
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
漆谷 真 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60332326)
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| 研究分担者 |
和泉 唯信 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (10335812)
森野 豊之 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (10397953)
守村 敏史 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 准教授 (20333338)
依馬 正次 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 教授 (60359578)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
16,250千円 (直接経費: 12,500千円、間接経費: 3,750千円)
2025年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
2024年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
2023年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2022年度: 7,540千円 (直接経費: 5,800千円、間接経費: 1,740千円)
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| キーワード | 筋萎縮性側索硬化症 / FUS / DHX30 / RNA / 低分子スクリーニング / Fused in sarcoma (FUS) / 変異遺伝子スクリーニング |
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| 研究開始時の研究の概要 |
我々は家族性ALSの原因の１つであるP525L FUSタンパク質の結合タンパク質としてミトコンドリアヘリカーゼDHX30を同定した。DHX30は変異FUSとの結合によって機能を喪失する。本研究はDHX30は変異FUSとの結合阻害分子の同定と、さらに家族性ALSのリスク遺伝子としての可能性を検証することで、ALSの新たな病態解明と治療法開発を目指すものである。
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| 研究実績の概要 |
申請期間で予定している研究計画はDHX30をALSの病態を握る鍵分子と捉え、①FUSとDHX30の結合を阻止する分子をスクリーニングし、②PiggyBacシステムを用いて作出する新たな変異FUSトランスジェニックマウスを作出し、有効性を検討する。③原因遺伝子が未決定の家族性ALS患者においてDHX30遺伝子解析を行い、変異遺伝子の同定と病原性の検証を行う。④作出変異について②と同技術を用いてトランスジェニックマウスを作製し、表現型解析を行う。というものである。2022年度は以下の成果が得られた。
①共同研究者である徳島大学和泉、森野が100例のALS患者の遺伝子解析を行い、その一部にDHX30の一塩基置換変異を認め、一部は毒性が示唆される変異であったが非ALS対照群と頻度に有意差がなかった。②2400個のFDA承認薬剤についてDHX30-FUSの結合阻止低分子のスクリーニングを行い結合阻止する分子24個、結合を増強する分子を6個同定した。FUSのknock-in細胞を作成し、DHX30の遺伝子導入後の共焦点顕微鏡検査法所見を用いた結合阻止効果の評価系を確立した。③家族性ALSにおけるDHX30の遺伝子変異の検索を継続中で有り、その間、家族性ALSの原因となるP525L FUSの新たなノックインマウスの作製を開始した。エクソンの変異のみでは表現型がわずかであると報告されており、3末端非翻訳領域の変異コンストラクトを構築中である。CRSP-CAS9を用いた2段階のノックイン作業を進めており、第1段階のマウスが生まれたところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
以下計画ごとに進捗を自己評価する
①FUSとDHX30の結合を阻止する分子をスクリーニングする
市販のライブラリー1240種類の1次スクリーニングを終え、候補分子を24種類同定した。さらに結合を高める分子の同定にも成功しており、これらを有効活用することによって、治療薬の開発のみならずFUSとDHX30の結合を介したALS分子病態の解明にも有用であることが期待される。②PiggyBacシステムを用いて作出する新たな変異FUSトランスジェニックマウスを作出し、有効性を検討する：P525L FUSを発現する遺伝子改変マウスを作製するに当たり、Piggy bacシステムの使用と同様に、新たなノックインマウスを作製することとした。単なる塩基置換のみでは無く、3末端非翻訳領域に変異を有する家族性ALS症例が報告されており、共同研究者の依馬とP525Lとなる塩基置換変異に加えて3'UTR変異を加えたキメラコンストラクトの作製を行っている。③原因遺伝子が未決定の家族性ALS患者においてDHX30遺伝子解析を行い、変異遺伝子の同定と病原性の検証を行う。 現在DHX30の変異遺伝子の有無を検討中である。④作出変異について②と同技術を用いてトランスジェニックマウスを作製し、表現型解析を行う。③の最終候補が絞れていないため未作成である。
よって①～④のうち、①～③は順調あるいは計画以上に進捗していると考えているが、④が③が修了することが前提のため、「ほぼ計画通り」と自己評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2023年度は以下の研究を予定している
①FUSとDHX30の結合を阻止する分子をスクリーニングする：同定された候補分子について、免疫沈降法と経口二重染色後の共焦点顕微鏡による評価で結合阻止効果、結合増強効果を確認する。その際、必要濃度と細胞毒性についても同時に評価する。スクリーニング結果の再現性が取れた後、変異FUS毒性に対する保護効果、ミトコンドリアの諸機能（ATP産生能、酸化的リン酸化、酸化ストレス）の障害改善効果を培養細胞にて検証し、さらに有望な分子を絞り込む。
市販のライブラリー1240種類の1次スクリーニングを終え、候補分子を24種類同定した。さらに結合を高める分子の同定にも成功しており、これらを有効活用することによって、治療薬の開発のみならずFUSとDHX30の結合を介したALS分子病態の解明にも有用であることが期待される。
②新たな変異FUSトランスジェニックマウスを作出し、有効性を検討する：新規P525Lノックインマウスの作製を進め、胎児や初代ニューロン細胞を用いた早期の評価の開始とともにマウスの表現型を、握力、ロタロッド、体重変化など行動解析と、脳脊髄切片の免疫組織化学解析を進める。
③④原因遺伝子が未決定の家族性ALS患者においてDHX30遺伝子解析を行い、変異遺伝子の同定と病原性の検証を行う。 さらに100家系でDHX30遺伝子の変異の有無について解析を行う。我々が家族性ALSに同定したDHX30変異患者は残念ながら発症者の遺伝子解析が出来ていないが、構造解析上毒性の強い変異である。新規遺伝子変異が同定されない場合、この変異遺伝子を有するトランスジェニックマウスを作製する予定としている。
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