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肝がん細胞の進化による転移過程を司るドライバー遺伝子の同定

研究課題

研究課題/領域番号 23K24317
補助金の研究課題番号 22H03056 (2022-2023)
研究種目

基盤研究(B)

配分区分基金 (2024)
補助金 (2022-2023)
応募区分一般
審査区分 小区分53010:消化器内科学関連
研究機関福井大学

研究代表者

中本 安成  福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40293352)

研究分担者 平松 活志  福井大学, 学術研究院医学系部門, 客員准教授 (30646849)
山下 太郎  金沢大学, 医学系, 教授 (90377432)
島上 哲朗  金沢大学, 保健管理センター, 助教 (50436820)
野阪 拓人  福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 講師 (70748441)
研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2024年度)
配分額 *注記
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2024年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2023年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
2022年度: 6,760千円 (直接経費: 5,200千円、間接経費: 1,560千円)
キーワード肝細胞がん / 転移 / ドライバー遺伝子 / 免疫チェックポイント阻害薬 / 循環腫瘍細胞
研究開始時の研究の概要

進行がんに対する最新の免疫チェックポイント阻害薬(ICI)治療は、既存の治療を上回る効果を発揮しているが、根治的な抗がん作用としては限定的である。そこで、進行肝細胞がんに対するICI治療中に肝内・肝外転移を生じた患者において、末梢血の循環腫瘍細胞(CTC)からがん転移を引き起こすドライバー遺伝子を同定し、新たな分子創薬シーズとして提案する。これより、本研究成果は進行肝がんに対する新規の分子標的治療の開発に繋がるものと期待される。

研究実績の概要

進行肝細胞がんに対する最新の免疫チェックポイント阻害薬(ICI)治療は、既存の分子標的薬や化学療法を上回る治療効果を発揮しているが、根治的な抗がん作用や生命予後の改善効果は限定的である。本計画では、進行肝がんに対するICI治療経過において、患者末梢血の循環腫瘍細胞(CTC)をシングルセル解析(scRNA-Seq)し、治療耐性・転移を呈した患者に特有な責任候補遺伝子群を抽出した。
1)患者CTCの採取と細胞分子病態の解析: 肝癌に対するICI:Atezolizumab-Bevacizumab併用療法(Atezo-Bev)の治療前、3週後、効果判定時に末梢血CTCを採取した。がん進展に関連する373遺伝子の発現変化を次世代シーケンサー(NGS)で解析し、GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)でパスウェイ解析を行った。
2)治療耐性・転移の責任候補遺伝子群の抽出: 治療有効PR群のCTC数は治療経過で減少した(治療前/効果判定時:141 vs. 58,p=0.01)。NGS解析ではPR群のCTCはアポトーシス経路関連遺伝子(FAS,TP53)の発現が、PD群ではTGF-β経路関連遺伝子(CDKN2B, GRB2, PIK3R1)の発現が有意に上昇していた(p<0.05)。
3)TGF-β経路関連遺伝子による早期治療反応性: 治療3週後の末梢血CTCにおいて、TGF-β経路関連遺伝子を詳細に検討したところ、PR/SD群で発現が低下しPD群で発現亢進していた(p<0.05)。この結果は、TGF-β経路関連遺伝子がAtezo-Bev治療に対する早期反応性を反映するバイオマーカーである可能性を示唆した。
これより、肝がんICI治療中の循環腫瘍細胞における遺伝子発現が治療効果と相関しており、がん進展・治療耐性と関連するドライバー遺伝子となる可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究において、令和5年度は1)-3)が計画されていた。ほぼ予定通りに進捗しており、3年計画の3年目:令和6年度に向けて、4)ゲノム編集技術を用いた遺伝子ノックアウト、がすでに開始されている。おおむね順調に進展しているものと考えられ、4)として継続中の計画は以下のごとくである。
4)ゲノム編集技術を用いた遺伝子ノックアウト ⇒3)で選択された候補遺伝子群について、以下の手順でCRISPR-Cas9システムによりノックアウトする。
a. ライブラリーの作成:治療標的遺伝子に対する一本鎖ガイドRNA(sgRNA)を、プラスミドベクターpCRISPR-LvSG03に組込む。 b. レンチウイルス粒子の精製、濃縮:[a.のsgRNA配列を組込んだpCRISPR-LvSG03/パッケージングpCMV-dR8-2DVP/エンベロープpCMV-VSV-G]をHEK293FT細胞に導入し、48時間後の培養上清を濃縮する。 c. sgRNAによる遺伝子ノックアウト:b.のウイルス粒子をCas9エンドヌクレアーゼを恒常的に発現する肝がん細胞株(PLC/PRF/5, C3A, SK-HEP-1他)に感染導入して、puromycinにより非導入細胞を除去し、sgRNA導入細胞集団を樹立する。
※ 樹立された細胞集団における治療標的遺伝子のノックアウトは、次の4)にて検証する。

今後の研究の推進方策

当初の計画通り、1)-3)に加えて4)が進展しており、今後は以下の5)の研究を予定している。
5)転移能の in vivo スクリーニングによるドライバー遺伝子の選択 ⇒4)のsgRNAによって候補遺伝子がノックアウトされた肝がん細胞集団について、in vivo マウスモデルでの転移能を評価しドライバー候補遺伝子を選択する。
a. がん細胞株のsgRNA導入率:4)がん細胞集団のsgRNA頻度をNGS解析する。 b. in vivo 転移モデル:4)がん細胞集団をNSGマウスにおいて、門脈注入(肝転移);尾静脈注入(肺転移)して、2-4週間後の転移巣(個数、サイズ)を定量する。NSGマウスは、T/B/NK細胞の欠損により、移植細胞の生着率が高い。 c. 転移巣のsgRNA導入率:b.転移組織からゲノムDNAを抽出して、sgRNA頻度をNGS解析する(MAGeCKワークフロー)。 ※ a.- c.導入率が低下したsgRNAを検出することによって(ネガティブ選択)、そのsgRNAが標的とする宿主遺伝子が、がん転移のドライバー候補遺伝子として抽出される。
6)がん転移のドライバー遺伝子の非臨床試験 ⇒4)ドライバー候補遺伝子に関して、in vitro / in vivo 実験系おける機能的解析を行う。 a. in vitro 評価系: a-1) EMT誘導能、a-2) 薬剤耐性、アポトーシス、a-3) 細胞増殖、a-4) 浸潤活性、a-5) 細胞周期、について検討する。 b. in vivo 評価系(非臨床試験): 免疫能の正常な肝がん転移モデル(immunocompetent, inbredマウス)を用いて、がん転移の制御能を評価する。 ※ 1)-5)で選択されたがん転移のドライバー候補遺伝子について、6)での転移能が検証されたものは新たな創薬シーズとして提案する。

報告書

(2件)
  • 2023 実績報告書
  • 2022 実績報告書
  • 研究成果

    (20件)

すべて 2024 2023 2022 2021

すべて 雑誌論文 (9件) (うち国際共著 1件、 査読あり 9件、 オープンアクセス 9件) 学会発表 (10件) (うち国際学会 10件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] Isolation of mucosa-associated microbiota dysbiosis in the ascending colon in hepatitis C virus post-sustained virologic response cirrhotic patients2024

    • 著者名/発表者名
      Midori Yohei、Nosaka Takuto、Hiramatsu Katsushi、Akazawa Yu、Tanaka Tomoko、Takahashi Kazuto、Naito Tatsushi、Matsuda Hidetaka、Ohtani Masahiro、Nakamoto Yasunari
    • 雑誌名

      Frontiers in Cellular and Infection Microbiology

      巻: 14 ページ: 1371429-1371429

    • DOI

      10.3389/fcimb.2024.1371429

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Longer Survival and Preserved Liver Function after Proton Beam Therapy for Patients with Unresectable Hepatocellular Carcinoma2023

    • 著者名/発表者名
      Nosaka Takuto、Matsuda Hidetaka、Sugata Ryotaro、Akazawa Yu、Takahashi Kazuto、Naito Tatsushi、Ohtani Masahiro、Kinoshita Kazuyuki、Tsujikawa Tetsuya、Sato Yoshitaka、Maeda Yoshikazu、Tamamura Hiroyasu、Nakamoto Yasunari
    • 雑誌名

      Current Oncology

      巻: 30 号: 4 ページ: 3915-3926

    • DOI

      10.3390/curroncol30040296

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] High correlation of hepatic shear wave velocity with esophageal varices complication rate in patients with chronic liver diseases2023

    • 著者名/発表者名
      Namikawa Shouichi、Nosaka Takuto、Matsuda Hidetaka、Akazawa Yu、Takahashi Kazuto、Naito Tatsushi、Ohtani Masahiro、Nakamoto Yasunari
    • 雑誌名

      BMC Gastroenterology

      巻: 23 号: 1 ページ: 169-169

    • DOI

      10.1186/s12876-023-02821-4

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Hepatocellular Carcinoma Progression Promoted by 5-Lipoxygenase Activity in CD163(+) Tumor-Associated Macrophages.2023

    • 著者名/発表者名
      Nosaka T, Murata Y, Takahashi K, Naito T, Ofuji K, Matsuda H, Ohtani M, Hiramatsu K, Imamura Y, Goi T, Nakamoto Y.
    • 雑誌名

      Biomed Pharmacother.

      巻: 162 ページ: 114592-114592

    • DOI

      10.1016/j.biopha.2023.114592

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書 2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Guselkumab in Patients With Moderately to Severely Active Ulcerative Colitis: QUASAR Phase 2b Induction Study.2023

    • 著者名/発表者名
      Peyrin-Biroulet L, Allegretti JR, Rubin DT, Huang KG, Shipitofsky N, Zhang H, Wilson R, Han C, Feagan BG, Sandborn WJ, Panes J, Hisamatsu T, Lichtenstein GR, Sands BE, Dignass A; QUASAR Study Group.
    • 雑誌名

      Gastroenterology

      巻: 65 号: 6 ページ: 1443-1457

    • DOI

      10.1053/j.gastro.2023.08.038

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Longer survival and preserved liver function after proton beam therapy for patients with unresectable hepatocellular carcinoma.2023

    • 著者名/発表者名
      Nosaka T, Matsuda H, Sugata R, Akazawa Y, Takahashi K, Naito T, Ohtani M, Kinoshita K, Tsujikawa T, Sato Y, Maeda Y, Tamamura H, Nakamoto Y.
    • 雑誌名

      Curr Oncol.

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Clinical practice guidelines for autoimmune hepatitis2022

    • 著者名/発表者名
      Ohira H, Takahashi A, Zeniya M, Abe M, Arinaga-Hino T, Joshita S, Takaki A, Nakamoto N, Kang JH, Suzuki Y, Sogo T, Inui A, Koike K, Harada K, Nakamoto Y, Kondo Y, Genda T, Tsuneyama K, Matsui T, Tanaka A.
    • 雑誌名

      Hepatol Res.

      巻: 52 号: 7 ページ: 571

    • DOI

      10.1111/hepr.13776

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Cholesterol crystal embolism in multiple organs after transarterial chemoembolization for hepatocellular carcinoma: An autopsy case report.2022

    • 著者名/発表者名
      Yamashita J, Nosaka T, Takahashi K, Naito T, Ofuji K, Matsuda H, Ohtani M, Hiramatsu K, Kobayashi M, Nakamoto Y.
    • 雑誌名

      Medicine (Baltimore)

      巻: 101(39) 号: 39 ページ: e30769-e30769

    • DOI

      10.1097/md.0000000000030769

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Regulatory function of interferon‐inducible 44‐like for hepatitis B virus covalently closed circular DNA in primary human hepatocytes2021

    • 著者名/発表者名
      Nosaka Takuto、Naito Tatsushi、Murata Yosuke、Matsuda Hidetaka、Ohtani Masahiro、Hiramatsu Katsushi、Nishizawa Tsutomu、Okamoto Hiroaki、Nakamoto Yasunari
    • 雑誌名

      Hepatology Research

      巻: 52 号: 2 ページ: 141-152

    • DOI

      10.1111/hepr.13722

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Identification of Novel Antiviral Host Factors by Functional Gene Expression Analysis using in vitro HBV Infection Assay Systems.2023

    • 著者名/発表者名
      Nosaka T, Naito T, Akazawa Y, Takahashi K, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y.
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Molecular Signature of Peripheral Circulating Tumor cells in Cancer Progression of Hepatocellular Carcinoma Patients Treated by Aterolimumab Plus Bevacizumab.2023

    • 著者名/発表者名
      Murata Y, Nosaka T, Naito T, Takahashi K, Akazawa Y, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y.
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Lymphocyte-Related Nutritional Markers and Muscle Volume Assessment are useful for Predicting Prognosis in Liver Cirrhosis Complicated with Portal Hypertension,2023

    • 著者名/発表者名
      Yamamoto A, Nosaka T, Akazawa Y, Takahashi K, Naito T, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y.
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] High Correlation of Hepatic Shear wave Velocity with Esophageal Varices Complication Rate in Patients with Chronic Liver Diseases.2023

    • 著者名/発表者名
      Yamamoto A, Namikawa S, Nosaka T, Akazawa Y, Naito T, Takahashi K, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y.
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Effects of Proton Beam Therapy on Local Control and Hepatic Reserve in Unresectable Hepatocellular Carcinoma.2023

    • 著者名/発表者名
      Sugata R, Nosaka T, Akazawa Y, Takahashi K, Naito T, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y.
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Analysis of Mucosa-Associated Dysbiosis Related to Bile Acid Metabolism in Post-SVR Hepatitis C Patients Complicated with Esophageal Varices2022

    • 著者名/発表者名
      Midori Y, Hiramatsu K, Nosaka T, Akazawa Y, Takahashi K, Naito T, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Influence of Lifestyle-Related Factors on Hypervascularization in Preneoplastic Nodules of Hepatocellular Carcinoma after HCV Eradication2022

    • 著者名/発表者名
      Tanaka T, Nosaka T, Murata Y, Akazawa Y, Takahashi K, Naito T, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Stem Cell Signature of Peripheral Circulating Tumor Cells correlated with therapeutic effects of Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable HCC patients2022

    • 著者名/発表者名
      Murata Y, Nosaka T, Takahashi K, Naito T, Ofuji K, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Usefulness of Hepatic Shear Wave Velocity for Noninvasive Prediction of Esophageal Varices in Patients with Chronic Liver Diseases2022

    • 著者名/発表者名
      Namikawa S, Nosaka T, Akazawa Y, Naito T, Takahashi K, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Hepatocellular Carcinoma-Derived GM-CSF Induces Leukotriene Production in Tumor-Associated Macrophages Contributing to Tumor Progression2022

    • 著者名/発表者名
      Nosaka T, Murata Y, Akazawa Y, Naito T, Takahashi K, Matsuda H, Ohtani M, Nakamoto Y
    • 学会等名
      AASLD The Liver Meeting 2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [産業財産権] 抗B型肝炎ウイルス剤、および、その利用2024

    • 発明者名
      中本安成、野阪拓人、村田陽介、並川正一
    • 権利者名
      福井大学
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      2024-009021
    • 出願年月日
      2024
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書

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公開日: 2022-04-19   更新日: 2024-12-25  

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