心臓特異的スーパーエンハンサーの相分離型転写ファクトリーによる転写機構の解明

• 研究課題/領域番号: 23K24327
• 補助金の研究課題番号: 22H03066 (2022-2023)
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 基金 (2024); 補助金 (2022-2023)
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53020:循環器内科学関連
• 研究機関: 兵庫医科大学
• 研究代表者: 塚本 蔵 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (80589151)
• 研究分担者: 松岡 研 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 准教授 (90826190)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円); 2024年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円); 2022年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円)
• キーワード: スーパーエンハンサー / ナトリウム利尿ペプチド / 相分離型転写ファクトリー / 心臓特異的スーパーエンハンサー / 相分離型転写ファクトリーモデル / ナトリウム利尿ペプチド遺伝子 / 心臓 / 転写機構

研究開始時の研究の概要

心不全病態の力学的負荷に反応してナトリウム利尿ペプチドの転写が劇的に活性化する現象は、心臓病学における極めて重要かつ心臓特異的転写反応であるが、その分子機序の理解は進んでいない。近年、細胞種特異的な遺伝子の転写を制御するDNA調節領域としてスーパーエンハンサーが注目されている。そこでは転写調節因子群が局所的に高密度で凝集・相分離することで、転写が効率的に活性化される（相分離型転写ファクトリーモデル）。本研究では、我々が同定した心不全感受性スーパーエンハンサーCR9に対して相分離型転写ファクトリーの概念を導入し、心臓特異的な転写反応の分子機序解明を目指す。

研究実績の概要

本研究は我々が同定した心不全感受性スーパーエンハンサーCR9に対して相分離型転写ファクトリーの概念を導入し、心臓特異的な転写反応の分子機序を解明することを目的とする。
まず、作成したCR9ノックアウト（CR9-KO）マウスの心室組織におけるナトリウム利尿ペプチド遺伝子（NppaとNppb）の発現レベルが高度に抑制されている事を確認した。また大動脈弓部縮窄手術による心不全負荷においても、CR9-KOマウスにおけるNppaとNppb遺伝子の発現誘導は野生型と比較して有意に抑制されることを確認した。また、ATAC-sequence解析とChIP-sequence解析の結果、CR9領域がNppa及びNppb遺伝子領域のクロマチン構造とクロマチン修飾を制御していることが解明された。このことは、CR9領域に対してCRISPR/dCa9システムを利用したCRISPR-activationおよびCRISPR-inhibitionシステムを利用した培養心筋細胞実験でも確認できた。以上よりCR9領域がエンハンサーとしてNppa、Nppb遺伝子の発現を制御する可能性がin vivoで証明された。
次に、野生型とCR9-KOマウスの心室組織を用いて4C解析を実施した。野生型で認められるCR9領域とNppb, Nppaのプロモーター領域の相互作用が、CR9-KOでは減少していたことから、CR9がエンハンサーとして働き、NppbおよびNppa遺伝子のプロモーター領域と相互作用していることがin vivoで証明できた。
最後に、NppaとNppbの転写バーストをライブで可視化できるシステムの構築に着手し、現在、CR9、Nppa、Nppb領域を含むBACを入手し、これにMS2、PP7、MCP-GFP、dt-Tomato-PCPなどの遺伝子の導入を試みている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

転写のイメージングシステムの構築はやや遅れているが、その反面、in vivoの実験が予想以上に進んでいる。

今後の研究の推進方策

転写イメージングシステムをiPS細胞で構築することとし、CR9、Nppa、Nppb領域を含むBACを入手し、これにMS2、PP7、MCP-GFP、dt-Tomato-PCPなどの転写イメージングに必要な遺伝子配列を組み込んでいる。iPS細胞が完成すれば心筋細胞に分化させて、NppaとNppbの転写バーストをライブで可視化する予定である。また、定量single-molecule RNA FISH法を利用して、NppaとNppb遺伝子から転写されたばかりのRNAの可視化を試み、成功している。今後はCR9領域とNppaとNppbのRNAとの位置関係や、スーパーエンハンサーを構成するmediator群との位置関係について検討する予定である。
また、CR9領域に結合してエンハンサー活性を制御する転写因子やmediator群を4種類同定しており、これらの転写因子群が実際に培養心筋細胞でNppaおよびNppb遺伝子の発現を制御すること、さらにCR9を中心とした転写ファクトリー内に存在することを示す。
最後にin vivoと培養細胞の実験をまとめて論文化する。

研究成果

• [雑誌論文] Association Between B-Type Natriuretic Peptide Deficiency and Left Ventricular Concentric Hypertrophy in Subclinical Individuals (2024)
  • 著者名/発表者名: Okamoto Chisato、Tsukamoto Osamu、Hasegawa Takuya、Matsuoka Ken、Amaki Makoto、Kanzaki Hideaki、Izumi Chisato、Takashima Seiji、Ito Shin、Kitakaze Masafumi
  • 雑誌名: JACC: Asia 巻: 4 号: 1 ページ: 87-88
  • DOI: 10.1016/j.jacasi.2023.10.002
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Restoration of Cardiac Myosin Light Chain Kinase Ameliorates Systolic Dysfunction by Reducing Superrelaxed Myosin (2023)
  • 著者名/発表者名: Hitsumoto T, Tsukamoto O, Matsuoka K, Li J, Liu L, Kuramoto Y, Higo S, Ogawa S, Fujino N, Yoshida S, Kioka H, Kato H, Hakui H, Saito Y, Okamoto C, Inoue H, Hyejin J, Ueda K, Segawa T, Nishimura S, Asano Y, Asanuma H, Tani A, Imamura R, Komagawa S, Kanai T, Takamura M, Sakata Y, Kitakaze M, Haruta JI, Takashima S.
  • 雑誌名: Circulation 巻: - 号: 25 ページ: 1902-1918
  • DOI: 10.1161/circulationaha.122.062885
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 心不全病態特異的エンハンサークラスターによるNa利尿ペプチド遺伝子の転写制御機構 (2023)
  • 著者名/発表者名: 井上 聖, 松岡 研, ゾ・ヘジン, 塚本 蔵, 高島 成二
  • 学会等名: 日本生化学会