| 研究課題/領域番号 |
23K24332
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| 補助金の研究課題番号 |
22H03071 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分53020:循環器内科学関連
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
星野 温 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50737210)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2024年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
2023年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
2022年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
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| キーワード | 線維化 / セクレトーム / スクリーニング |
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| 研究開始時の研究の概要 |
組織線維化は心不全をはじめ多くの疾患の共通の病態となっているが治療法は確立されていない。そのため線維化研究は各領域において注目されている研究テーマであるが、本研究では“線維芽細胞活性化時の転写制御ネットワークをCRISPRスクリーニングで包括的に解明する”という、独自の視点で研究を展開している。線維芽細胞活性化セクレトーム制御において、新たにKeap1-NRF2経路とFLCN-mTOR-TFE経路が重要であることが判明した。今後は抑制的転写制御のメカニズムを転写複合体解析から明らかにするとともに、マウスの心臓線維化モデルで両経路による線維化を評価し、それぞれの活性化薬の開発にも取り組む。
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| 研究実績の概要 |
圧負荷心不全モデルの活性化線維芽細胞におけるNRF2発現を評価するために、ROSA td-TOMATO x Opstn-MerCreMerマウスを準備して、td-TOMATO陽性細胞のソーティングで線維芽細胞を回収し、NRF2の染色やWBで定評評価を試みた。しかし、腎臓のUUOモデルではtd-TOMATO陽性細胞が顕著に確認されたが、圧負荷心筋では陽性細胞が乏しく評価が難しかった。また心臓線維芽細胞でなく心筋細胞のKeap1-NRF2経路の高線維化作用の検討としてMyh6-MerCreMerを用いた心筋特異的Keap1ノックアウトマウスを構築して検討したところ、高線維化効果は確認されなかった。
NRF2が線維芽細胞関連因子に対して転写抑制に働く機序としてDDX54がコリプレッサーとして関与している仮説に対しては、Keap1ノックアウト時の線維化関連遺伝子の転写抑制がDDX54欠損細胞ではキャンセルされており、DDX54が関与する仮説を支持する結果が得られた。
Keap1阻害・Nrf2活性化薬による臓器線維化抑制効果に関しては、中分子ペプチドが難渋したためベンチャー企業が保有する化合物で評価を行った。その化合物の薬物動態から肺への吸入投与が最も高線維化薬効が期待できると考えられたため、肺線維症モデルにて評価を行う事とした。まずマウス疾患モデルとしてはブレオマイシン投与による肺線維症モデルの構築に取り組んだ。文献で見られるような肺組織の線維化の再現に難渋しているが投与期間の最適化等にて薬効評価ができるモデル構築に取り組んでいる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
心筋においてPostn lineageでの評価が難しかったためTcf21-MerCreMerマウスを構築して評価することとしたため準備に時間を要している。
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| 今後の研究の推進方策 |
Postn-MerCreMerとKeap1-floxマウスの交配で線維芽細胞特異的Keap1ノックアウト
を作製して検討を進めたが、圧負荷心不全モデルでは既報と異なり、筋線維芽細胞で認めるPostnの発現が不十分であり評価が難しかったため、広く線維芽細胞系統で発現が認められるTcf21-CreERT2ノックインマウスを新たに作製する。このマウスを用いて線維芽細胞特異的Keap1ノックアウトの臓器線維化抑制効果を評価するとともに、病態においてKeap1, Nrf2の変化を検討する。
Keap1阻害・Nrf2活性化薬による臓器線維化抑制効果に関しては、ベンチャー企業が保有する化合物の評価を肺線維化モデルで行う。ブレオマイシン投与後1週間後に化合物を気管内噴霧スプレーで連日投与し、3週間後に肺の線維化をマッソン・トリクローム染色やヒドロキシプロリンで評価する。
またDDX54がコリプレッサーとしてはたらく仮説に対してはより直接的な証明として、免疫沈降法にてNrf2とDDX54の直接結合を評価する。
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