| 研究課題/領域番号 |
23K24445
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| 補助金の研究課題番号 |
22H03186 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56010:脳神経外科学関連
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
荒川 芳輝 京都大学, 医学研究科, 教授 (20378649)
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| 研究分担者 |
棗田 学 新潟大学, 脳研究所, 特任准教授 (00515728)
中川 正宏 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (10431850)
土井 大輔 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点講師 (10587851)
垣内 伸之 京都大学, 白眉センター, 特定准教授 (90839721)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)
2025年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
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| キーワード | グリオーマ / 正常脳 / IDH変異型クローン / 先制医療 / 3次元的網羅的ゲノム解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、正常脳組織のゲノム解析によるIDH変異型グリオーマ発生の分子基盤を解明し、早期診断・早期予防治療の標的分子群を同定する。正常脳組織を用いたIDH変異クローン、クローンによる組織再構築、クローンの進化と多様性の獲得、大脳オルガノイドにおけるIDH変異クローン拡大について未だ十分に解明されていない。そこで、正常組織での変異クローンの拡大と組織再構築に関する包括的な理解、がんの発生、進展、組織の老化に関する新たな視点での理解を探索する。
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| 研究実績の概要 |
グリオーマは、腫瘍内多様性のために、単一の細胞内シグナルを標的とする薬剤では治癒困難である。そこで、グリオーマ発生前の早期診断、早期予防治療などの先制医療の開発が必要となっている。IDH変異型グリオーマでは、IDHがドライバー遺伝子となる。正常脳組織、特に若年の正常脳組織においてIDH変異を有するクローンの存在や発生部位、IDH変異を有するクローンが乏突起膠腫、星細胞腫へと異なったクローン拡大に至る分子基盤について十分に明らかとなっていない。そこで、本研究では、正常脳組織のゲノム解析によるIDH変異型グリオーマ発生の分子基盤を解明し、先制医療を開発することを目的としている。デジタルPCRでIDH変異を同定した新潟大学脳研究所所蔵の正常脳組織を用いてIDH変異の免疫染色解析を行い、IDH変異クローンの局在の同定を試みた。しかし、明らかなIDH変異クローンの集積する部位の同定に至らなかった。そこで、新たに微少検体から少数クローンの存在を同定できる可能性があるDuplex sequencing法を用いた低エラー率・高深度のターゲットキャプチャーシーケンシングを適用することで、0.2%～の感度で検出できる系を確立した。そして4人の正常剖検脳について新規にマルチサンプリングを行い脳腫瘍関連変異の探索を行った。その結果、4人分の脳から検出されたユニーク変異70個を同定した。human induced pluripotent stem（iPS）細胞にIDH1変異を導入するためのベクターを開発し、iPS細胞で作成したIDH1変異大脳オルガノイドの樹立を目指している。確立できた単一細胞RNA/DNA同時解析を膠芽腫で行い、EGFR R108G陽性と陰性の集団を分離し、それぞれのRNA発現プロファイルを同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
デジタルPCRでIDH変異を同定した新潟大学脳研究所所蔵の正常脳組織を用いてIDH変異の免疫染色解析を行ったが、IDH変異クローンの局在が確認できなかったため、新たな解析手法を開発する必要があった。そこで、低エラー率・高深度のターゲットキャプチャーシーケンシングを適用することで、高感度で変異検出できる系を確立したことで新たに正常脳の遺伝子変異を検出できるようになった。しかし、正常脳では、IDH変異は予想外に低頻度であり、その他の遺伝子に変化があることが明らかとなった。確立した単一細胞RNA/DNA同時解析は、生細胞濃縮時の選択、アリルドロップアウトなどの影響を受けやすいことが判明した。数種類の膠芽腫検体において、他の方法のRNAシークエンスでcross validationを試みたが、再現できていなかったことから、実験系の再設定を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
新たに微少検体から少数クローンの存在を同定するディープシークエンス法を確立し、4人の正常剖検脳で遺伝子変異を確認したことから、さらに複数例の正常剖検脳の追加解析を行っている。IDH1変異を導入したhuman induced pluripotent stem（iPS）細胞を樹立する。iPS細胞で作成したIDH1変異大脳オルガノイドの樹立のために、安定したIDH1変異iPS細胞の培養条件を設定する。単一細胞RNA/DNA同時解析では、IDH野生型の膠芽腫が遺伝子変異の観点からは腫瘍の均一性が示唆された。そこで、遺伝子変異不均一性が高いIDH変異再発グリオーマを用いて単一細胞RNA/DNA同時解析を行い、IDH変異型グリオーマの悪性転化メカニズムの同定を目指す。
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