| 研究課題/領域番号 |
23K24453
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| 補助金の研究課題番号 |
22H03194 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56020:整形外科学関連
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
池淵 祐樹 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20645725)
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| 研究分担者 |
本間 雅 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (60401072)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2025年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2024年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2023年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
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| キーワード | Wntシグナル / 骨代謝 / 抗体創薬 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、網羅的なレポーターアッセイ手法を用いて、全てのWnt-Fzd-共受容体の組み合わせによる下流シグナル経路の定量的な活性化パターンを取得することで、Wntシグナルの高精細な解読を目指す。この情報を基盤として、Fzdおよび共受容体の細胞外ドメインを認識する単鎖化抗体可変領域(scFv)を組み合わせた二重特異性の改変抗体をデザインすることで、特定のWntシグナル経路を選択的に活性化する方法論の確立を目標とする。最後に、取得した改変抗体が新たな創薬標的となり得るか、骨粗鬆症モデルマウスを用いて検証する。
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| 研究実績の概要 |
前年度までに樹立したマウスE1-NR細胞（CRISPR-Cas9システムを利用して、マウス骨芽細胞由来MC3T3-E1細胞に内在性に発現する全てのFzd（10種類）・共受容体（6種類）を欠失させた細胞株）を用いた解析により、β-カテニン経路に続いて、PCP経路、GPCR経路の各下流シグナル経路の応答性を評価した。PCP経路はSRF-RE応答配列、GPCR経路はNFAT、CREBの各応答配列を組み込んだNanoLucレポーターシステムを用いることで、Wnt-Fzdの組み合わせによる影響を網羅的に測定した。一部経路に関しては、Wntシグナルにおける古典経路であるβ-カテニン経路との交差反応性が報告されていることも踏まえて、本年度は、共受容体なし、もしくはLrp5/6導入によりβ-カテニン経路の活性化が起こる条件下での検証を実施した。既報にある通り、いくつかの限定的なWnt-Fzdの組み合わせによってシグナルの活性化・抑制が確認されたことに加えて、Fzdサブクラス毎に特徴的なプロファイル情報など、これまでには十分に得られていなかった重要な知見が得られている。
また、上記のWntシグナルの全容解読と並行して、β-カテニン経路に対してシグナル入力を可能とする改変抗体の構築を試みている。Fzd8、Fzd9の細胞外ドメインをベイトとしたファージディスプレイ法を実施し、それぞれに結合性を示すscFv候補配列を複数同定した。同様の方法でのscFv取得、および得られたscFvの結合特異性の検証のため、Fzdおよび共受容体の各細胞外領域とIgG Fc領域の組み替えタンパク質の調製を進めており、最終的な改変抗体の構造に組み込む上で最適と考えられるscFv配列の探索を続けることを予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ほぼ当初の計画通りに進捗している。今後に計画している解析に関しても必要な準備等は進んでおり、研究を遂行する上で問題はない。
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| 今後の研究の推進方策 |
樹立したマウスE1-NR細胞を用いて、引き続き、各シグナル経路の解読を進める。共受容体としての機能が報告されている受容体型チロシンキナーゼであるRor1/2、Ryk、Ptk7の共受容体4種類に関して、同様のレポーターアッセイを行い、その機能や特性の差異を明らかとする。また、各レポーターを用いた評価において特徴的な変動が認められたWnt・Fzd・共受容体の組み合わせについては、CaシグナルのプローブとなるFura-2、PCP経路の過程で活性化するRhoAを直接モニター可能なBRETシステムを新たに構築することで、さらに頑健な評価を目指す。
一連の解析から特定される、シグナル経路を選択的に活性化させるFzd・共受容体の組み合わせに関して、シグナル入力が可能な改変抗体の構築を行う。前年度までで進めているβ-カテニン経路に対する抗体の作出をまずは目標とし、Lrp5/6と、特定のFzdの分子間を架橋する二重特異性改変抗体を構築する。Fzd、Lrp5/6、あるいはRTKの細胞外ドメインをベイトとして用いたファージディスプレイによって、 高親和性に結合するscFvを単離する。分子種間の親和性も考慮して、結合特異性の高いscFv配列をさらに選抜した後に、これらを目的に応じてリンカーで連結し、IgG Fc領域との融合タンパク質に組み換えることで改変抗体を取得し、選択的なシグナル経路の活性化を誘導できる分子構造を探索する。
最後に、得られた改変抗体を骨病態疾患モデルマウス（加齢、卵巣摘出など）に投与し、骨芽細胞、破骨細胞のバランス変動や骨代謝全体に与える影響を評価することを計画している。
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