| 研究課題/領域番号 |
23K24590
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| 補助金の研究課題番号 |
22H03332 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分58020:衛生学および公衆衛生学分野関連:実験系を含む
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
保川 清 京都大学, 農学研究科, 教授 (30397559)
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| 研究分担者 |
兒島 憲二 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (40542759)
吉宗 一晃 日本大学, 生産工学部, 教授 (50325700)
柳原 格 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 免疫部門, 部長 (60314415)
滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助教 (70263126)
藤原 伸介 関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (90263219)
福田 青郎 関西学院大学, 生命環境学部, 研究員 (30421283)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2024年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2023年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
2022年度: 5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円)
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| キーワード | リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法 / リコンビナーゼ / 一本鎖DNA結合タンパク質 / 鎖置換DNAポリメラーゼ / ATP再生酵素 / 等温核酸増幅法 / ピルビン酸キナーゼ / uvsY / 鎖置換DNAポリメ ラーゼ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
基礎の展開としては、作製した高機能タンパク質・酵素のX線結晶構造解析を行い、野生型と立体構造を比較し、各タンパク質・酵素の高機能化の構造的要因を明らかにする。応用展開としては、最も高性能なタンパク質・酵素を使用し、長期間の常温保存が可能なRPA試薬を開発し、新型コロナウイルスを含めた病原体の現場での迅速な検出を実現させる。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、病原体の現場検出に最適と注目されている等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）で使用する、中温性のリコンビナーゼ（Rec）、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）、鎖置換DNAポリメラーゼ（Pol）、ATP再生酵素（ARE）の活性と安定性を、全アミノ酸スキャニング変異導入法により向上させる。一方、好熱性微生物から新規のRec、SSB、Pol、AREを取得し、活性と安定性を比較することを目的としている。①中温性のAREであるヒトピルビン酸キナーゼ（PK）を大腸菌で発現させ菌体から調製した。PKを使用したRPAは、従来から使用されているウサギクレアチンキナーゼ（CKr）を使用したRPAと同等の性能を有した。PKはCKrよりも高い耐熱性を有したことから、PKを使用したRPA試薬の高い保存安定性が示唆された。②好熱性細菌であるAeribacillus pallidus (H1) とGeobacillus zalihae (C1)から好熱性のPol（H1-PolとC1-Pol）を単離した。そしてH1-PolとC1-Polを大腸菌で発現させ菌体から精製した。H1-PolあるいはC1-Polを使用したRPAは、従来から使用されているBacillus stearothermophilus由来Pol（Bst-Pol）を使用したRPAよりも高い感度を有した。H1-Polを使用したRPAの凍結乾燥試薬は、少なくとも2週間室温に置いても、液状試薬と同程度の性能を有した。このことから、本凍結乾燥試薬は現場での使用に適していることが示唆された。③中温性のRecであるuvsYの溶解度を上げるために、Lys91-Glu134に変異を導入した全アミノ酸スキャニングライブラリーを作製した。600クローンをスクリーニングの結果、有望な変異体16種を単離した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
等温核酸増幅法は病原体の現場での迅速な検出に好ましいが、使用するタンパク質・酵素が不安定なため試薬の冷凍保存が必要である。コロナパンデミック社会を迎え、環境を対象とした病原体検査が公衆衛生上喫緊の課題となり、試薬の常温保存が求められている。申請者らはこれまでに、耐熱型逆転写酵素と高活性DNAポリメラーゼを開発し、これらを用いて新型コロナウイルスのRT-PCRを開発した。本研究では、病原体の現場検出に最適と注目されている等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）で使用する、中温性のリコンビナーゼ（Rec）、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）、鎖置換DNAポリメラーゼ（Pol）、ATP再生酵素（ARE）の活性と安定性を、全アミノ酸スキャニング変異導入法により向上させる。一方、好熱性微生物から新規のRec、SSB、Pol、AREを取得し、活性と安定性を比較することを目的としている。2022年度は、①中温性のAREであるヒトピルビン酸キナーゼ（PK）、②好熱性細菌であるAeribacillus pallidus (H1) とGeobacillus zalihae (C1)由来の好熱性PolであるH1-PolとC1-Pol、③中温性のRecであるuvsYについて成果をあげた。
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| 今後の研究の推進方策 |
・Rec：全アミノ酸スキャニングライブラリー法によりT4ファージ由来RecであるuvsXとuvsYの性能を向上させる。RadA、RadB、RadCの評価を行う。
・SSB：T4ファージ由来SSBであるgp32の抗体を取得し、これを用いたRPA法の新規な検出法を構築する。TmaSSBとTK1961の評価を行う。
・Pol：H1-Polの結晶を作製し、立体構造を解析する。
・ATP再生系酵素：PKの評価を継続する。TK0511の評価を行う。
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