| 研究課題/領域番号 |
23K24601
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| 補助金の研究課題番号 |
22H03343 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分58020:衛生学および公衆衛生学分野関連:実験系を含む
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
小野 竜一 国立医薬品食品衛生研究所, 毒性部, 室長 (10401358)
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| 研究分担者 |
高田 修治 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, システム発生・再生医学研究部, 部長 (20382856)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2024年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2023年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
2022年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円)
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| キーワード | ゲノム編集 / mRNAワクチン / レトロトランスポゾン / レトロトランスポソン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
申請者は、マウス受精卵にゲノム編集を実施した際、およそ 20 % の胚の DNAの二重鎖切断 (DSB ; DNA double strand break) 部位にレト ロトランスポゾンや内在性遺伝子の逆転写産物、および ベクターの DNA 断片が挿入されることを明らかにしている。
この様な非意図な配列の挿入は、ゲノム編集遺伝子治療の障害となると同時に、mRNA ワクチンの逆転写産物がゲノム中に挿入される可能性を 示唆している。そこで、ゲノム編集の際にオンターゲット部位に非意図配列や mRNA ワクチンの逆転写産物挿入のリスクの可能性を検討し、そ れを回避する手段の開発を行う。
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| 研究実績の概要 |
申請者らは、マウス受精卵においてゲノム編集を実施した際に、およそ20%の胚の DNAの二重鎖切断 (DSB ; DNA double strand break) 部位(オンター ゲットサイト)にレトロトランスポゾンや内在性レトロウィルス、内在性遺伝子の逆転写産物、および CRISPR/Cas9 プラスミドの DNA 断片が挿入されるオン ターゲットリスクが存在することを報告している(Ono R., et al., Scientific Reports, 2015)。さらに、エクソソームを介して他動物種より細胞に取り込ま れた mRNA の逆転写産物が、オンターゲットサイトに取り込まれる、すなわち、エクソソームを介した遺伝子水平伝搬機構が存在することを明らかにしている (Ono R., et al., Communications Biology, 2019)。
この様な非意図配列の挿入(オンターゲットリスク)は、ゲノム編集遺伝子治療の大きな障害となると同時に、COVID-19のワクチンとして使用されている mRNA ワクチンの逆転写産物がゲノム中に挿入される可能性を示唆している。そこで、本研究の目的は、ゲノム編集の際にオンターゲットサイトに非意図配列および mRNA ワクチンの逆転写産物が挿入するオンターゲットリスクの可能性を検討し、それらを回避する手段の開発である。
2023年度研究においては、昨年度に開発に成功したデジタルPCRを利用したmRNAの逆転写効率の検出方法を利用して、マウス受精卵中のレトロトランスポゾンのコピー数を定量を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、昨年度に作成したモデルmRNAをインジェクションしたマウス受精卵を材料に、我々が開発したデジタルPCRを利用したmRNAの逆転写効率の検出方法を利用して、マウス受精卵中のレトロトランスポゾンの定量を行っていることから、当初の予定通りに本研究課題は進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに、デジタルPCRにより1コピーの検出を行うことが難しいことが判明した。そこで、ゲノム中に複数コピー存在する配列をリファレ ンスとすることで、絶対定量の精度が上がることが期待される。そこで、来年度は、これらのリファレンス配列を用いることで、受精卵や培養 細胞中のEGFPのコピー数の絶対定量を行う。また、ゲノム編集における非意図配列挿入に関わる候補遺伝子の単離に成功しており、これらの遺伝子を欠損させて培養細胞を作製し、それらの評価を行う。
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