| 研究課題/領域番号 |
23K24777
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| 補助金の研究課題番号 |
22H03520 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
宮崎 拓郎 昭和大学, 医学部, 准教授 (80398693)
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| 研究分担者 |
佐竹 炎 公益財団法人サントリー生命科学財団, 生物有機科学研究所・統合生体分子機能研究部, 主幹研究員 (20280688)
小野 弥子 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 副参事研究員 (20392376)
松本 英成 昭和大学, 医学部, 准教授 (30861132)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
16,770千円 (直接経費: 12,900千円、間接経費: 3,870千円)
2025年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2024年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2023年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2022年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
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| キーワード | mRNAスプライシング / マクロファージ / 肥満 / 死細胞クリアランス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
動物実験としてはCWC22コンディショナルKOマウスの表現型解析を行う。肥満症モデル、寒冷刺激負荷、脂肪分解実験ならびに動脈硬化症モデ ルに対する脂肪移植実験を行う。マクロファージを単離してRNA沈降により責任mRNAスプライシングの解析も行う。また、予備実験で検出され ているCWC22ターゲットXについて、リコンビナントタンパク質をマクロファージ細胞ラインに導入し、分子レベルでメカニズムを検討する。さ らに、冠動脈疾患患者のイメージングと血中のスプライシングバリアントYの定量を行い、両者の関連性について検討する。同時に、冠動脈疾 患患者の脂肪組織におけるCWC22の活性を免疫組織化学的に検出する。
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| 研究実績の概要 |
動物実験としてはCWC22コンディショナルノックアウトマウスの表現型解析を行った。本年度は高脂肪食誘発性の肥満症モデルの解析を中心に検討した。血中代謝物をメタボローム解析したところ、ノックアウトマウスにて一部の核酸代謝物の変動が検出された。生化学的アッセイで、当該代謝物の挙動を追跡した。また、脂肪組織マクロファージを単離して、如何なる生理的なプロセスにより上記mRNAスプライシングが制御されるか検討した。RNAseqによ りスプライスバリアントの網羅解析も行い、約20%がCWC22ターゲット遺伝子と一致することが判明した。
エフェロサイトーシス活性を評価する目的で、CWC22ターゲットXについて、リコンビナントタンパク質をマク ロファージ細胞ラインに導入し、分子レベルでメカニズムを検討した。Xは、恒常的スプライシングにより生じるisofomr1を単独で導入した場合は細胞膜に局在するが、これを選択的スプライシングで生じるisoform2と同時に導入すると、小胞体型に分布が変化した。isoform間の結合部位に変異を導入するとヘテロ重合は抑制され、細胞内局在も細胞膜型を呈した。また、変異体ではエフェロサイトーシス活性も回復した。
エフェロサイトーシスにより、上記核酸代謝物が死細胞から回収されるとの作業仮説を立て、これを骨髄由来マクロファージで検証した。その結果、エフェロサイトーシスが引き金となり、核酸代謝物の遊離が検出された。このような核酸代謝物のサルベージ応答は、ゲノム編集によりisoform2を特異的に下方制御することで抑制され、CWC22の発現レベルにも依存していた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
表現型解析は順調に進行しており、CWC22のターゲット遺伝子も同定できた。さらに、スプライシングの制御不全により表現型異常が生じる原因も解明した。
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| 今後の研究の推進方策 |
論文投稿を視野に入れて、裏付けの検討を進める。アンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングし、当該スプライスバリアントを特異的に下方制御する。
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