| 研究課題/領域番号 |
23K24788
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| 補助金の研究課題番号 |
22H03531 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
柴田 貴広 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (80447838)
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| 研究分担者 |
菊地 良介 岐阜大学, 医学部附属病院, 臨床検査技師長 (30721435)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)
2024年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2023年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 8,970千円 (直接経費: 6,900千円、間接経費: 2,070千円)
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| キーワード | 細胞外小胞 / 糖尿病性腎症 / 疾患マーカー / プロテオミクス / 糖尿病 / エクソソーム |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、尿中エクソソームに含まれるタンパク質の量的・質的変動を基軸とした、糖尿病性腎症の超早期診断マーカーの創出を目的とする。糖尿病モデルラットの発症前段階における尿中エクソソームタンパク質の量的・質的変動を明らかにすることで、新規の分子マーカーを同定する。さらに、ヒト臨床検体を用いることで、超早期マーカーとしての有用性についても評価する。
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| 研究実績の概要 |
2023年度に実施したプロテオミクス解析により、糖尿病モデルラット尿中EVで増加するタンパク質として見出した候補タンパク質に関して、ウェスタンブロットにより定量解析を行った。糖尿病モデルラットおよびコントロールラットそれぞれについて、5、10、20、25週齢時に採尿し、超遠心法によりEVを採取した。各EVサンプルをウェスタンブロットにより評価したところ、5週齢から有意に増加すること、またその増加は25週齢にかけてさらに顕著になることを明らかにした。
このタンパク質がEVの中に局在しているのかを検討した。ゲル濾過クロマトグラフィーにより糖尿病モデルラット尿EVサンプルを分画したのち、各画分における候補タンパク質の存在をウェスタンブロットにより確認した。その結果、CD9などのEVマーカーと同じ画分に候補タンパク質が検出された。また尿中の非EVタンパク質であるTHPとは共局在しなかったことから、候補タンパク質は確かにEVに由来するタンパク質であることが明らかとなった。さらに、候補タンパク質がEVに内包されているかを確認するために、尿EVサンプルにプロテナーゼKを処理した。その結果、膜タンパク質は酵素消化されたものの、候補タンパク質は消化されなかった。また、このタンパク質の酵素活性を測定したところ、EVを破壊する界面活性剤を添加しないと酵素活性が認められなかった。これらの結果から、候補タンパク質はEVに内包されて存在していることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
質量分析による定量はいまだ確立できていないものの、ウェスタンブロットにより候補タンパク質が有意に増加することを明らかにできた。また候補タンパク質がEVの中に局在することを明らかにできた。
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| 今後の研究の推進方策 |
質量分析を利用した安定同位体希釈法による定量法の確立を引き続き行う。また、レクチンプルダウンアッセイや免疫組織染色により、腎臓のどの組織・細胞で候補タンパク質が増加するかを明らかにする。さらに、食餌制限による候補タンパク質の変動も併せて解析する。
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