| 研究課題/領域番号 |
23K25005
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| 補助金の研究課題番号 |
22H03751 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分63030:化学物質影響関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
紙谷 浩之 広島大学, 医系科学研究科(薬), 教授 (10204629)
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| 研究分担者 |
河合 秀彦 広島大学, 医系科学研究科(薬), 准教授 (30379846)
鈴木 哲矢 広島大学, 医系科学研究科(薬), 助教 (20573950)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2024年度: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)
2023年度: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)
2022年度: 7,670千円 (直接経費: 5,900千円、間接経費: 1,770千円)
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| キーワード | 活性酸素 / DNA 損傷 / 8-hydroxyguanine / APOBEC3 / 遠隔作用変異 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
8-Hydroxyguanine（8-OH-Gua、活性酸素により生ずる）に代表される比較的小さな構造変化を伴うDNA損傷が生じると、損傷が生じた部位に遺伝情報の誤り（変異）が生じる。さらに、8-OH-Guaの存在により、損傷部位から離れた位置においても変異が生じる（遠隔作用変異）。そこで、本研究では、この遠隔作用変異の生成機構を明らかとする。
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| 研究実績の概要 |
(1) 遠隔作用変異に関与する APOBEC3 分子種の同定：ヒト U2OS 細胞における各 APOBEC3 分子種の発現を調べたところ、APOBEC3B の発現量が一番多かった。また、APOBEC3B は核に局在する分子種であるため、APOBEC3B を siRNA によりノックダウンした。その結果、遠隔作用変異頻度が大幅に減少した。したがって、APOBEC3 が遠隔作用変異誘発に寄与していること、U2OS 細胞においては APOBEC3B が主に関与していることを明らかにした。
(2) OGG1 以外の DNA グリコシラーゼ（修復酵素）の役割の解明：NTH1 のノックダウンにより変異体頻度が上昇し、NEIL1 のノックダウンにより変異体頻度が減少する傾向が観察された。一方、NEIL2 と NEIL3 をノックダウンしても変異体頻度は同程度であった。
(3) ニック生成による遠隔作用変異誘発：ニック（3’-末端は水酸基、5’-末端は水酸基またはリン酸基）を有する DNA が非常に高い頻度で遠隔作用変異を誘発することを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
遠隔作用変異に APOBEC3 が関与することを証明し、U2OS 細胞においては APOBEC3B が主に変異の原因となっていることを明らかにし、遠隔作用変異誘発が 8-OH-Gua の生成 → OGG1 による 8-OH-Gua の除去と脱塩基部位の生成 → APOBEC3 によるシトシンの脱アミノ化 という主な流れが明らかにできたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) OGG1以外のDNAグリコシラーゼ（修復酵素）の役割の解明：令和4年度の研究によって、NTH1とNEIL1の関与を示唆する結果が得られた。そのことを確認するため、変異のレポーター遺伝子であるsupF遺伝子の変異体の配列を調べ、遠隔作用変異頻度への影響を明らかにする。
(2) 8-OH-Gua:A塩基対とMUTYHが誘発する遠隔作用変異：従来調べていた遠隔作用変異は、8-OH-Gua:C塩基対の存在によって、8-OH-Guaを導入した鎖のG塩基に生じる変異である。8-OH-GuaはAとも対を形成することができ、複製の際に鋳型DNAのAに対して8-OH-dGTPが取り込まれると8-OH-Gua:A塩基対が生じる。次に、8-OH-Gua:A塩基対のAを除去するMUTYHが鋳型であった鎖のAを除去することが生じれば、Aの鎖のG塩基に変異が生じる可能性がある。そこで、8-OH-Gua:A塩基対を有する複製型プラスミドDNAをMUTYHをノックダウンさせたU2OS細胞に導入して本仮説を検証する。
(3) リボ体による遠隔作用変異誘発：令和4年度の研究により、ニックを有するDNAが非常に高い頻度で遠隔作用変異を誘発することを明らかにした。そこで、ニックを有する修復中間体の存在が明らかにされているリボ体（塩基部はG）を複製型プラスミドDNAに導入し、遠隔作用変異頻度を調べる。
(4) 遠隔作用変異誘発におけるウラシルDNAグリコシラーゼの役割：現在の遠隔作用変異のモデルでは、APOBEC3がCをUに脱アミノ化する（令和4年度の研究結果）。その後、生じたUをウラシルDNAグリコシラーゼが除去することにより脱塩基部位が生じて複雑な塩基置換変異を誘発すると推定している。そこで、ウラシルDNAグリコシラーゼをノックダウンさせて、8-OH-Guaが誘発する塩基置換変異への影響を調べる。
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