| 研究課題/領域番号 |
23K26786
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| 補助金の研究課題番号 |
23H02093 (2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分37020:生物分子化学関連
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
村上 一馬 京都大学, 農学研究科, 准教授 (80571281)
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| 研究分担者 |
泉尾 直孝 東京大学, 先端科学技術研究センター, 助教 (50722261)
片平 正人 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (70211844)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円)
2026年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2025年度: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)
2024年度: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)
2023年度: 5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円)
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| キーワード | 核酸アプタマー / エクソソーム / 神経変性疾患 / NMR / ドラッグデリバリーシステム / アプタマー / 核酸医薬 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
RNAアプタマーは，標的分子に対する高い結合能と選択性を特徴とする．最近，本研究代表者らは凝集性タンパク質であるαシヌクレイン（αSyn）の毒性発現と関わりの深いN末領域に対するRNAアプタマー（1R6）を開発し，1R6はαSynの細胞内凝集を阻害した．本研究では，RNAアプタマーによる細胞内認識機構の解明と疾患治療を目的として，NMR解析から1R6の短鎖化と点置換で配列の最適化を行う．さらに，細胞内の作用機構をin cell NMRを用いて明らかにする．続いて，脳関門透過型の人工エクソソームを用いて，最適化1R6による病態モデル生物の治療効果を調べる．
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| 研究実績の概要 |
研究代表者らが開発したαシヌクレイン（αSyn）に対するRNAアプタマー（1R6）の構造解析と相互作用解析を行った．1R6の構造予測と点置換実験より，1R6の短鎖化を行った．短鎖化1R6の1次元NMRを測定したところ，塩基間相互作用に基づく複数の分子内水素結合が観測されたことから，立体構造を形成し，末端構造の揺らぎに関する知見を得た．αSynの部分ペプチドを用いた相互作用解析も行った．またαSyn過剰発現するショウジョウバエを用いた運動能力試験を行ったところ，1R6による治療効果を示す予備的データを得た．一方，人工エクソソームへの1R6の封入を高効率で実現するため，エレクトロポレーション法の有効性を検討し，GFPを基準物質として用いて条件の最適化を行った．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
αSynは凝集することによって神経細胞毒性を示し，神経細胞死に誘導する．今年度は研究代表者らが開発したαSynに対するRNAアプタマー（1R6）の構造解析と相互作用解析を行った．1R6の構造予測と点置換実験より，1R6の結合に重要な部分配列（短鎖化1R6）を同定した．短鎖化1R6の1次元NMR測定を複数のバッファーとpHを検討したところ，塩基間相互作用に基づく複数の分子内水素結合を観測し，化学シフトの帰属に成功した．バイオレイヤー干渉（BLI）実験より，短鎖化1R6と強力な結合定数を示したαSynの部分ペプチドを用いて，相互作用解析に関するHSQC実験も行った．続いて，個体レベルでの1R6の治療効果を調べる目的で，αSyn過剰発現するショウジョウバエを用いた予備実験を行ったところ，αSynが誘導する運動能力の低下を1R6が緩和する可能性が示唆された．一方，水溶性物質を脂質ナノ微粒子に封入する方法について，有効な方法が模索されてきたが，本研究では人工エクソソームへの1R6の高効率封入を目指した．本年度は，エレクトロポレーション法の有効性を検討し，GFPを基準物質として用いて条件の最適化に成功した．以上の進捗状況より，「おおむね順調に進展している」と判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
短鎖化した1R6の各種NMR実験より3次元情報を得る．αSynとの相互作用部位については，αSynの部分ペプチドあるいは標識した全長αSynを用いて結合ダイナミクスを明らかにする．続いて，in cell NMR測定も進め，実験条件の検討を行うとともにin vitro NMR実験の結果と比較することで，生体環境下でのタンパク質―核酸相互作用について考察する．本研究のもう一つの目的である1R6の治療効果について，培養細胞およびショウジョウバエモデルを用いたin vivo実験を推進する．さらに，αSynをマウスの脳室内に投与し，病態評価系を構築するとともに，ヒト病態脳を用いた染色実験も行う．なお分担研究者・泉尾の異動に伴い，人工エクソソームに関する性状解析をさらに進める．
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