| 研究課題/領域番号 |
23K27111
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| 補助金の研究課題番号 |
23H02418 (2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
大嶋 篤典 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 教授 (80456847)
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| 研究分担者 |
田中 康太郎 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 助教 (70916668)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円)
2026年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2025年度: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2024年度: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2023年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
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| キーワード | ラージポアチャネル / クライオ電子顕微鏡構造解析 / ナノディスク再構成 / large pore channel / 脂質膜再構成 / クライオ電子顕微鏡 / 開閉メカニズム / 試料調製 / ギャップ結合チャネル / 膜透過機構 / 分子動力学 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
イオンや代謝産物を透過するlarge pore channelの膜透過機構を理解するために、生体膜に近い環境下で構造解析を行うことが必要である。本研究ではlarge pore channelをナノディスクまたはリポソームといった脂質二重膜に再構成し、クライオ電子顕微鏡を用いて高分解能構造解析を行い、タンパク質―脂質間相互作用から脂質がチャネルの開閉に寄与する分子メカニズムを解明する。
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| 研究実績の概要 |
細胞間コミュニケーションを担うギャップ結合ファミリータンパク質はイオンやセカンドメッセンジャーを含むヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドなどを非選択的に通す径の大きな通路を持つ「large pore channel」と呼ばれる。これらの開閉機構の分子基盤の詳細は解明されておらず、近年の構造研究から脂質膜内におけるギャップ結合関連タンパク質の構造研究の重要性が示唆されている。
当初はヒトpannexin-1(Panx1)のリポソーム再構成を試みたが、再構成効率とチャネルの安定性が得られなかったため、ヒトPanx3のナノディスク再構成からクライオ電子顕微鏡構造解析を行う方針とした。
今年度はPanx3の精製、ナノディスク再構成、クライオ電子顕微鏡構造解析まで達成した。C末タグの最適化と可溶化・精製に使用する界面活性剤を変更し、安定な精製条件を探索した。野生型のPanx3をPOPCとMSP2N2によるナノディスクに再構成し、そのクライオ電子顕微鏡構造解析を行って、2.95Å分解能の密度マップを得た。チャネル孔の内側に通路を埋める二層の密度が確認でき、これは我々の先行研究であるPanx1のクライオ電子顕微鏡構造解析で見られた脂質二重層と解釈した密度に近いものであった。このコンフォメーションはクローズ状態と考えられるが、生理的な条件における閉構造であるかどうかを結論付けることは困難である。大阪大学との共同研究で行った電気生理学実験ではPanx3の野生型の活性は検出されなかった。これはPanx3の活性が失われているのか細胞膜表面に移行できないために活性が出なかったのか、という確認はできていないため、今後の検証が必要である。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
ギャップ結合ファミリータンパク質のヒトPanx3の脂質ナノディスク中における構造解析に成功しており、進展が見られた。チャネルのポアの内側に脂質を示唆する密度が確認されたが、開閉機構の解明に向けて異なるコンフォメーションの構造解析と、電気生理学的手法による機能解析が進行中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
Panx3のC末端欠失変異体を作製し、クライオ電子顕微鏡構造解析を目指す。精製したPanx3チャネルはナノディスク再構成を行って、構造解析の試料として用いる。アフリカツメガエル卵母細胞を用いた機能解析を並行して行い、構造と機能に基づいたチャネルコンフォメーションを議論する。
また、ラージポアチャネルのイネキシンギャップ結合チャネルを発現、精製し、ナノディスク再構成とクライオ電子顕微鏡構造解析を手掛ける。
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