| 研究課題/領域番号 |
23K27134
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| 補助金の研究課題番号 |
23H02441 (2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
森下 英晃 九州大学, 医学研究院, 教授 (90783499)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円)
2025年度: 6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)
2024年度: 6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)
2023年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
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| キーワード | オートファジー / 液適 / マウス / 液滴 / 選択的基質 / 細胞質 / 選択的オートファジー / 肝細胞 / 定量的プロテオミクス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞内における液－液相分離現象とは、ある特定のタンパク質・生体分子からなる「液滴」が細胞内に生じる現象であり、細胞機能の制御に重要な役割を担っている。選択的オートファジーはそれらの液滴の代表的な分解機構であるが、その生理的意義はほとんど不明である。本研究ではユビキチン化タンパク質を含むp62液滴をモデルとして、液滴を標的とした選択的オートファジーの生理機能を解明する。本研究により、選択的オートファジーの生理機能についての包括的理解が進むことが期待される。
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| 研究実績の概要 |
液－液相分離現象は、ある特定のタンパク質・RNAなどの生体分子から構成された非膜型の「液滴」が細胞内に生じる現象である。液適は細胞の機能制御に重要な役割を担っており、その形成、分解は生理作用の制御にきわめて重要である。選択的オートファジーはそれらの液滴の分解を担う代表的な細胞内分解機構であるが、その分子機構や生理的意義はほとんど不明である。本研究では、細胞内恒常性維持に必須なユビキチン陽性p62 bodyをモデルとして、それらの液滴を標的とした選択的オートファジーの生理機能を解明することを目的としている。本年度は、前年度に確立した細胞破砕液の調整条件やセルソーター(ソニーSH800S)を用いた液滴ソーティングの条件を用いて、さまざまな組み合わせのp62 body液適形成条件下で解析を行った。本解析には、細胞質中に多数のp62 body（各種肝疾患において出現するマロリー・デンク体に類似した構造と考えられている）を自発的に形成することが知られている肝細胞がん由来の細胞種などを用いた。顕微鏡およびウェスタンブロッティング解析によりソートした液滴の形態学的解析を行い、液滴をセルソーターで回収する最適な条件を確立しプロトコール論文として発表した。さらに、高感度な質量分析計(Thermo Orbitrap Eclipse)を用いた定量的プロテオミクス解析を実施し、複数の新規液滴局在基質を同定し、それらの詳細な局在、分解機序の解析を行った。一部の新規因子に関して、ノックアウトマウスの作製に着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画していたヒト細胞を用いた新規液滴構成因子同定法の確立に関して、最適条件を見出し、プロコール論文として発表した。さらに定量的プロテオミクスを用いて複数の新規液滴構成因子も同定できていることから、本プロジェクトはおおむね順調に進展しているといえる。液滴構成因子の機能やそれらの分解の生理的意義に関する実験系の立ち上げにも順調であり、本プロジェクトの研究基盤を確実に整備できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒト細胞を用いて同定した新規p62 body構成因子の局在、機能、分解の意義を検証するための実験を進める予定である。具体的には各種新規因子を検出可能な抗体、プローブを検討するとともに、それらの局在を超解像顕微鏡を用いてリアルタイムに可視化する。さらにノックアウトマウスの作製を進める。
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