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投影型MSイメージング法による脂質ラフト含有スフィンゴ脂質の可視化技術開発

研究課題

研究課題/領域番号 23K27316
補助金の研究課題番号 23H02625 (2023)
研究種目

基盤研究(B)

配分区分基金 (2024)
補助金 (2023)
応募区分一般
審査区分 小区分47020:薬系分析および物理化学関連
研究機関帝京大学

研究代表者

三枝 大輔  帝京大学, 薬学部, 准教授 (90545237)

研究分担者 可野 邦行  東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (50636404)
松本 洋太郎  東北大学, 薬学研究科, 講師 (90420041)
青木 順  大阪大学, 大学院生命機能研究科, 招へい教員 (90452424)
研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2026-03-31
研究課題ステータス 交付 (2024年度)
配分額 *注記
18,720千円 (直接経費: 14,400千円、間接経費: 4,320千円)
2025年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2024年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
2023年度: 6,630千円 (直接経費: 5,100千円、間接経費: 1,530千円)
キーワードMSイメージング / S1P / MALDI / スフィンゴ脂質 / 細胞外小胞 / 質量分析計
研究開始時の研究の概要

初めに、スフィンゴ脂質を細胞オルガネラレベルで検出できる MSイメージング法を開発する。検出された脂質分子種は、レーザーマイクロダイセクションとLC-MS/MSなどにより評価する。次に、脂質ラフトあるいはエクソソーム分泌過程で分布蓄積するスフィンゴ脂質を可視化する。エクソソームに含まれる脂質の評価には、LC-MS/MSを用いる。最終的には、病変部位に対し、開発したMSイメージング法を用いた脂質変動解析から創薬標的を明らかにする。

研究実績の概要

スフィンゴ脂質は、細胞膜形成あるいは脂質メディエーター機能により、生体の恒常性維持に必須の分子群であり、がんや免疫疾患発症に関連することが示唆されている。また、細胞膜に含まれる脂質ラフトや細胞外小胞のエクソソームの主要構成脂質でもあり、スフィンゴ脂質の代表分子であるスフィンゴシン一リン酸(S1P)を介したエクソソーム分泌機構が細胞間シグナル伝達に重要な役割を担うことが判っている。
しかしながら、スフィンゴ脂質変動を細胞膜脂質ラフトレベルで直接観察することは困難であり、機能解析の障壁となっていた。そこで本研究の目的は、スフィンゴ脂質を細胞オルガネラレベルで検出できるMSイメージング法を開発し、脂質ラフトあるいはエクソソーム分泌過程で分布蓄積するスフィンゴ脂質を可視化し、病変部位での変動を捉えることで創薬標的を明らかにすることである。
投影型MSイメージングによるオルガネラレベルでの可視化を実現するためには、各分析条件における高感度化が必須である。R5年度は、主に①投影型MSイメージング分析による細胞オルガネラ由来に含まれる分子の検出、②CyclicIMSによる糖セラミドの分離、③導電性粘着フィルムの高感度化、④Phostag誘導体化試薬の合成および⑤細胞外小胞に含まれるスフィンゴ脂質分析の最適化を実施した。今後開発した条件の再現性を評価し、全ての技術を組み合わせることにより、オルガネラレベルにおけるスフィンゴ脂質の可視化に挑戦する。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

R5年度の進捗は以下の通りである。①投影型MSイメージング分析は、細胞および脳組織切片の分析に挑戦したが、装置に設置する金属プレート上での細胞培養ならびに切片の作成が障壁となった。そこで、細胞培養を専門とする新潟大学の研究者に協力を得ることで、分析試料を準備し、投影型MSイメージング分析を実施することができた。現在データ解析中であるが、細胞オルガネラに分布する数種の分子のイメージング画像を取得することができている。
②CyclicIMSの糖セラミド異性体分離に挑戦したところ、イオンモードの工夫により、MS内部における分離に成功した。ゴーシェ病モデルマウスから得られた脳組織切片のMSイメージングに挑戦したところ、各種糖セラミドのイメージング画像を取得することができた(論文投稿準備中)。
③オルガネラレベルの脂質を高感度に分析することが必要であるため、導電性粘着フィルムの改良を試み、リン脂質分子種について、ITOコートガラスと同等のレベルまで高感度化することができた。さらに、適切な切片の厚みや電圧条件についても最適化し、本成果を論文発表した。
④新たに、ZnをMnに置き換えたPhostag誘導体化試薬を合成した。MALDI-MSによる分析を実施したところ、誘導体化されたS1P由来のスペクトルを確認することができた。一方、ZnのPhostagと比較してMnのPhostagはマトリックス結晶のサイズが大きいため、高空間分解能に向けて障壁となる可能性が考えられるため、精製過程を検証する必要がある。
⑤細胞外小胞に含まれる脂質分子種を分析するためには、LC-MS/MS分析による評価を実施する際にも分析法の高感度化が必須である。我々は、リン脂質分子種のテーリングを改善することにより、微量の細胞外小胞から複数の脂質分子種を精密に分析することに成功した。

今後の研究の推進方策

現在までに、オルガネラレベルのスフィンゴ脂質分析技術開発に向けた各種条件検討にて一定の成果が得られている。これらについては引き続き実施するが、R6年度は特に投影型MSイメージングによるスフィンゴ脂質の可視化に焦点を当てた研究を進める。
投影型MSイメージングによる細胞のイメージング画像を取得することができたが、目的とするスフィンゴ脂質のマススペクトル領域のピークは極めて少ないため、装置を目的のm/z領域を高感度に検出できるようチューニングする予定である。また、レーザーに用いるレンズ系統を更新したため、高感度分析できることが期待される。また、データ解析に時間を要するため、得られたスペクトルデータの解析の効率化を目指したデータ変換や可視化の方法を考案する。
R6年度の大きな課題となることは、Phostagに用いられるZnは、世界的な資源問題が生じ、極めて入手困難となった。従って、本研究の推進ならびに目標達成には新たな試薬が必要になる。R5年度は、Mnを基盤とした新たなPhostagの合成を試みた。試薬をMALDI分析したところ、Znと同等のピーク強度を得ることができたが、結晶の形状がZnと異なることが判明した。オルガネラレベルの分析を実施するためには、精製の工程を工夫する必要がある。以上の技術的な改良により、本研究の加速を図る。

報告書

(1件)
  • 2023 実績報告書
  • 研究成果

    (17件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (10件) (うち査読あり 10件、 オープンアクセス 10件) 学会発表 (7件)

  • [雑誌論文] Exploration of urine metabolic biomarkers for new-onset, untreated pediatric epilepsy: A gas and liquid chromatography mass spectrometry-based metabolomics study2024

    • 著者名/発表者名
      Akiyama Tomoyuki、Saigusa Daisuke、Inoue Takushi、Tokorodani Chiho、Akiyama Mari、Michiue Rie、Mori Atsushi、Hishinuma Eiji、Matsukawa Naomi、Shibata Takashi、Tsuchiya Hiroki、Kobayashi Katsuhiro
    • 雑誌名

      Brain and Development

      巻: 46 号: 4 ページ: 180

    • DOI

      10.1016/j.braindev.2023.12.004

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Dietary habits and plasma lipid concentrations in a general Japanese population2024

    • 著者名/発表者名
      Sato Mitsuharu、Hishinuma Eiji、Matsukawa Naomi、Shima Yoshiko、Saigusa Daisuke、Motoike Ikuko N.、Kogure Mana、Nakaya Naoki、Hozawa Atsushi、Kuriyama Shinichi、Yamamoto Masayuki、Koshiba Seizo、Kinoshita Kengo
    • 雑誌名

      Metabolomics

      巻: 20 号: 2

    • DOI

      10.1007/s11306-024-02087-1

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Improving the Signal Intensity of Cryosections Using a Conductive Adhesive Film in Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging2023

    • 著者名/発表者名
      Saigusa Daisuke、Saito Ritsumi、Kawamoto Komei、Uruno Akira、Kano Kuniyuki、Shimma Shuichi、Aoki Junken、Yamamoto Masayuki、Kawamoto Tadafumi
    • 雑誌名

      Mass Spectrometry

      巻: 12 号: 1 ページ: A0137-A0137

    • DOI

      10.5702/massspectrometry.A0137

    • ISSN
      2186-5116, 2187-137X
    • 年月日
      2023-12-12
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Local Delivery of Nimustine Hydrochloride against Brain Tumors: Basic Characterization Study2023

    • 著者名/発表者名
      Shao Xiaodong、Saito Ryuta、Sato Aya、Okuno Saori、Saigusa Daisuke、Saito Ritsumi、Uruno Akira、Osada Yoshinari、Kanamori Masayuki、Tominaga Teiji
    • 雑誌名

      The Tohoku Journal of Experimental Medicine

      巻: 261 号: 3 ページ: 187-194

    • DOI

      10.1620/tjem.2023.J069

    • ISSN
      0040-8727, 1349-3329
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Comprehensive study of metabolic changes induced by a ketogenic diet therapy using GC/MS- and LC/MS-based metabolomics2023

    • 著者名/発表者名
      Akiyama Mari、Akiyama Tomoyuki、Saigusa Daisuke、Hishinuma Eiji、Matsukawa Naomi、Shibata Takashi、Tsuchiya Hiroki、Mori Atsushi、Fujii Yuji、Mogami Yukiko、Tokorodani Chiho、Kuwahara Kozue、Numata-Uematsu Yurika、Inoue Kenji、Kobayashi Katsuhiro
    • 雑誌名

      Seizure: European Journal of Epilepsy

      巻: 107 ページ: 52

    • DOI

      10.1016/j.seizure.2023.03.014

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Distributions of CHN compounds in meteorites record organic syntheses in the early solar system2023

    • 著者名/発表者名
      Furukawa Yoshihiro、Saigusa Daisuke、Kano Kuniyuki、Uruno Akira、Saito Ritsumi、Ito Motoo、Matsumoto Megumi、Aoki Junken、Yamamoto Masayuki、Nakamura Tomoki
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 13 号: 1 ページ: 1-12

    • DOI

      10.1038/s41598-023-33595-0

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Metabolic profiling by integrated analysis with LC-MS and MSI2023

    • 著者名/発表者名
      Daisuke Saigusa
    • 雑誌名

      Medical Mass Spectrometry

      巻: 7 ページ: 2-16

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Identification of predictive biomarkers for diagnosis and radiation sensitivity of uterine cervical cancer using wide-targeted metabolomics2023

    • 著者名/発表者名
      Hishinuma Eiji、Shimada Muneaki、Matsukawa Naomi、Li Bin、Motoike Ikuko N.、Hagihara Tatsuya、Shigeta Shogo、Tokunaga Hideki、Saigusa Daisuke、Kinoshita Kengo、Koshiba Seizo、Yaegashi Nobuo
    • 雑誌名

      Journal of Obstetrics and Gynaecology Research

      巻: 49 号: 8 ページ: 2109

    • DOI

      10.1111/jog.15709

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Identification of predictive biomarkers for endometrial cancer diagnosis and treatment response monitoring using plasma metabolome profiling2023

    • 著者名/発表者名
      Hishinuma Eiji、Shimada Muneaki、Matsukawa Naomi、Shima Yoshiko、Li Bin、Motoike Ikuko N.、Shibuya Yusuke、Hagihara Tatsuya、Shigeta Shogo、Tokunaga Hideki、Saigusa Daisuke、Kinoshita Kengo、Koshiba Seizo、Yaegashi Nobuo
    • 雑誌名

      Cancer & Metabolism

      巻: 11 号: 1

    • DOI

      10.1186/s40170-023-00317-z

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Reduced glutathione level in the aqueous humor of patients with primary open-angle glaucoma and normal-tension glaucoma2023

    • 著者名/発表者名
      Sato Kota、Saigusa Daisuke、Kokubun Taiki、Fujioka Amane、Feng Qiwei、Saito Ritsumi、Uruno Akira、Matsukawa Naomi、Ohno-Oishi Michiko、Kunikata Hiroshi、Yokoyama Yu、Yasuda Masayuki、Himori Noriko、Omodaka Kazuko、Tsuda Satoru、Maekawa Shigeto、Yamamoto Masayuki、Nakazawa Toru
    • 雑誌名

      npj Aging

      巻: 9 号: 1 ページ: 28-28

    • DOI

      10.1038/s41514-023-00124-2

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] アンチ・ドーピングに資するバダデュスタット投与マウスを用いたサロゲートマーカー探索研究2024

    • 著者名/発表者名
      大橋智輝、中井琢、福内友子、山岡法子、小柴生造、山本雅之、鈴木教郎、三枝大輔
    • 学会等名
      日本薬学会第144回年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 小児てんかん患者の脳脊髄液に含まれる細胞外小胞リピドーム解析によるバイオマーカー探索2024

    • 著者名/発表者名
      石井亜里紗、福内友子、山岡法子、秋山倫之、三枝大輔
    • 学会等名
      日本薬学会第144回年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] ヒト前房水の細胞外小胞由来リピドームを標的とした緑内障早期診断マーカー探索2024

    • 著者名/発表者名
      西原詩織、佐藤孝太、藤岡周、横山悠、福内友子、山岡法子、中澤徹、三枝大輔
    • 学会等名
      日本薬学会第144回年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] イオンモビリティ搭載飛行時間MSによるスフィンゴ糖脂質異性体分離分析法開発2023

    • 著者名/発表者名
      井上莉那、可野邦行、福内友子、山岡法子、青木淳賢、三枝大輔
    • 学会等名
      第71回質量分析総合討論会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] LC/MSによる肺腺がん患者血漿由来細胞外小胞を用いたバイオマーカー探索2023

    • 著者名/発表者名
      岩崎裕子、本田健、植田幸嗣、福内友子、山岡法子、菱沼英史、松川直美、富樫亮、松谷哲行、関順彦、三枝大輔
    • 学会等名
      第71回質量分析総合討論会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 肺腺癌患者血漿由来細胞外小胞を対象としたメタボローム解析2023

    • 著者名/発表者名
      岩崎裕子、本田健、植田幸嗣、福内友子、山岡法子、菱沼英史、松川直美、富樫亮、松谷哲行、関順彦、三枝大輔
    • 学会等名
      第10回日本細胞外小胞学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] GC-MS/MSによるダプロデュスタット服用マウスの血漿および尿中メタボローム解析2023

    • 著者名/発表者名
      内田新菜、中井琢、福内友子、山岡法子、小柴生造、山本雅之、鈴木教郎、三枝大輔
    • 学会等名
      日本薬学会第144回年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書

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公開日: 2023-04-18   更新日: 2024-12-25  

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