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細胞内広域分子配向イメージングによる高次構造動態解析

研究課題

研究課題/領域番号 23K27348
補助金の研究課題番号 23H02657 (2023)
研究種目

基盤研究(B)

配分区分基金 (2024)
補助金 (2023)
応募区分一般
審査区分 小区分48010:解剖学関連
研究機関東京医科歯科大学

研究代表者

寺田 純雄  東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00262022)

研究分担者 川岸 将彦  東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
齊藤 健太  東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (60374659)
佐藤 啓介  東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60644044)
研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2026-03-31
研究課題ステータス 交付 (2024年度)
配分額 *注記
19,370千円 (直接経費: 14,900千円、間接経費: 4,470千円)
2025年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
2024年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
2023年度: 13,130千円 (直接経費: 10,100千円、間接経費: 3,030千円)
キーワード蛍光偏光 / ライブイメージング / 細胞骨格
研究開始時の研究の概要

従来の蛍光顕微鏡技術では利用されてこなかった蛍光偏光を活用する蛍光偏光プローブ技術-POLArIS法-を発展させ、細胞内広域分子配向イメージングを行い、電子顕微鏡によらなければ不可能であった生体分子の細胞内高次構造動態解析を実時間下に実現する。プローブと蛍光偏光顕微鏡の両者について改良を行い、細胞表層での観察に留まっていた分子配向イメージングを細胞内のより広い領域に拡大する。様々な観察対象から基礎学術的意義の高い知見を獲得することにより、蛍光偏光を利用した三次元的な分子配向イメージングの汎用化を達成する。

研究実績の概要

細胞内の広い領域における分子配向イメージングのための基盤技術開発として、特に新規に設計したタグシステムを利用した汎用プローブ作成の試みに成功した。POLArISプローブ作成の際の律速段階の一つが組換えバインダのスクリーニングであったが、原理的にこのスクリーニングをスキップして任意の標的分子を蛍光偏光標識する手法を確立した。
プローブの強度増強については試行実験を続行している。
また細胞内の広い領域における分子配向イメージングの試みとして、F-actinに結合するPOLArISプローブを薬剤誘導性に発現するトランスジェニックマウスのを利用したアクチン動態観察の準備を進めると共に、比較対象となるヒトデ卵母細胞を利用した検証実験を進めた。トランスジェニックマウスについてはドライバーマウスに予期せぬ問題点があることが判明し、そのトラブルシューティングに腐心したが、これを解決した。
並行して構造生物学的な解析・検討により、当初作成したプローブPOLArISactよりも性状が改善したプローブ作成に成功したので、このプローブを使用してヒトデ卵母細胞の発生過程におけるアクチン動態につき、高感度化した共焦点蛍光偏光顕微鏡を利用して観察した。細胞内におけるアクチン配向イメージングにおける像質が大幅に改善しており、従来知られていなかった細胞内構造変化が観測されつつあり、成果の発表を準備中である。
またこの他、蛍光偏光ライトシート顕微鏡の性能検証も進めている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

計画の基盤となるプローブの強度増強の試行錯誤で予想外に時間がかかっていること、顕微鏡の像質改善のために背面照射型CMOSカメラの導入を優先し購入を進めたが、海外為替レートの高騰からSLMの導入は厳しい状況にある。他方で新規に設計したタグシステムを利用した汎用プローブ作成の試みに成功したことから、標的分子認識バインダの探索の必要性が解消したので、この項目の遂行はスキップすることとした。ゲノム標識はプローブの強度増強が前提となるため、遂行が遅れている。他方で、改良したプローブ等により、予想外の知見が得られつつあり、こちらについては別途発表を準備している。

今後の研究の推進方策

プローブの強度増強が懸案であり、当初予定していた方法とは別のコンセプトでも試行を開始し、状況打開に注力する予定である。POLArISactの改良に成功したのでこのプローブを利用した実験を継続し、成果発表を目指す。また新規に設計したタグシステムを利用した汎用プローブを利用する等により、これまで観察の中心としてきたアクチン分子の他のターゲットについて、分子配向イメージングを実施する。高感度カメラを装着した共焦点レーザー走査型顕微鏡、ライトシート顕微鏡等を使用し、まずアンサンブルの分子動態を観察する予定である。

報告書

(1件)
  • 2023 実績報告書
  • 研究成果

    (10件)

すべて 2024 2023 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 学会発表 (9件) (うち国際学会 2件、 招待講演 2件)

  • [国際共同研究] ウッズホール海洋生物学研究所/CZ Biohub(米国)

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 線虫の初期胚でアクチンの位置と向きを可視化する2024

    • 著者名/発表者名
      船橋他
    • 学会等名
      第129回日本解剖学会総会全国学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 蛍光偏光顕微鏡による収縮環形成過程におけるアクトミオシン動態解析2024

    • 著者名/発表者名
      佐藤他
    • 学会等名
      第129回日本解剖学会総会全国学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 蛍光偏光顕微鏡と新規ミオシン配向プローブによる配向イメージング2024

    • 著者名/発表者名
      中井他
    • 学会等名
      第129回日本解剖学会総会全国学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 筋芽細胞の融合時におけるアクチン動態の蛍光偏光イメージング法の確立2024

    • 著者名/発表者名
      後藤他
    • 学会等名
      第129回日本解剖学会総会全国学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 蛍光偏光顕微鏡観察を目的とした簡便かつ汎用的標識法の開発2024

    • 著者名/発表者名
      飯田他
    • 学会等名
      第129回日本解剖学会総会全国学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] ライトシート蛍光偏光顕微鏡の開発2024

    • 著者名/発表者名
      齊藤他
    • 学会等名
      第129回日本解剖学会総会全国学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] Newly developed fluorescent polarization probe, POLArIS, uncovered global actin dynamics in starfish embryos2024

    • 著者名/発表者名
      Sumio Terada
    • 学会等名
      Kusumi-Lab Seminar, OIST
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Single-molecule orientation mapping by fluorescence polarization microscopy and blinking orientation probes2024

    • 著者名/発表者名
      Nori Nakai et al.
    • 学会等名
      Kusumi-Lab Seminar, OIST
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 動的なアクチン構造を可視化する改良型POLArISact (F-actin配向プローブ)の開発2023

    • 著者名/発表者名
      寺田他
    • 学会等名
      第111回 日本解剖学会関東支部集会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書

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公開日: 2023-04-18   更新日: 2024-12-25  

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