止血タンパク質の発現多様性と止血機能および止血以外の機能に関する基礎研究

• 研究課題/領域番号: 23K27372
• 補助金の研究課題番号: 23H02681 (2023)
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 基金 (2024); 補助金 (2023)
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分48040:医化学関連
• 研究機関: 国立研究開発法人国立循環器病研究センター
• 研究代表者: 小亀 浩市 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (40270730)
• 研究分担者: 樋口 由佳 (江浦由佳) 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 上級研究員 (30443477)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 18,850千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 4,350千円); 2025年度: 5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円); 2024年度: 5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円); 2023年度: 6,890千円 (直接経費: 5,300千円、間接経費: 1,590千円)
• キーワード: von Willebrand因子 / 蛍光タンパク質 / ノックインマウス / 発現多様性 / 心内膜 / 血液凝固

研究開始時の研究の概要

von Willebrand因子（VWF）は、血小板凝集と血液凝固因子の安定化により止血を促進するタンパク質である。巨大マルチマーを形成する分子特性が機能発現に効果を発揮すると同時に、生物学的解析の困難性をもたらす。これまで主に血管内皮と考えられてきたVWF産生部位に関し、全ての血管内皮が発現するわけではないことと、心臓ではほぼ心内膜のみに発現するという事実が最近判明した。本研究では、VWFに種々の蛍光タンパク質を融合したマウスを作製し、VWFが関与する生命現象を発現多様性に着目して解析する。止血因子に複数色の蛍光タンパク質を融合したモデル動物はこれまで無く、新たなアプローチの解析となる。

研究実績の概要

本研究は、止血タンパク質の発現多様性に着目し、止血機能および止血以外の機能に関する知見を蓄積するための基礎研究である。特にモデルタンパク質としてvon Willebrand因子（VWF）に重点を置く。VWFは、血小板凝集と血液凝固因子の安定化により止血を促進するタンパク質である。巨大マルチマーを形成する分子特性が機能発現に効果を発揮すると同時に、生物学的解析の困難性をもたらす。これまで主に血管内皮細胞と考えられてきたVWF産生部位に関し、全ての血管内皮が一様に発現するわけではないこと、心臓ではほぼ心内膜のみに発現することが最近判明した。本研究では、VWFにタグ配列を融合したマウスを新たに作製して解析する。令和５年度は、これらのマウスの作製と心内膜細胞の解析技術の確立を目指した。まず、種々の蛍光タンパク質融合VWFを発現するノックインマウスの作製を試み、VWF-mCherryノックインマウスの樹立に成功した。しかし、同時に計画していたVWF-mGreenLanternノックインマウス等の作製は、繰り返し実施したものの難航し、現時点でまだ得られていない。その原因は不明であるが、解決策として短鎖ペプチドタグ配列を融合したノックインマウスの作製を試み、樹立に成功した。これと並行し、心内膜細胞のVWFを解析するための準備に着手した。まず免疫組織化学的解析を行い、マウス心内膜に実際にVWFが局在することを確認した。次にマウス心内膜細胞の単離を試みたが、ラット向けの既存の単離方法では非常に困難であることが分かったため、現在、心内膜細胞以外の細胞の遊離を最大限に抑えるための酵素液暴露方法や酵素の種類等の検討を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

令和５年度は、種々の蛍光タンパク質融合VWFを設計し、それらを発現するノックインマウスを作製する計画を立てていた。そこでまず、赤色蛍光タンパク質mCherryの直接融合でVWFの構造・機能に影響が出ない位置を予測し、培養細胞発現でマルチマー形成を確認した。ゲノム編集によりVWF-mCherryノックインマウスを作製し、ホモ接合性マウスも獲得することができたので、これを用いた血漿VWFの解析を開始した。このストラテジーを土台にして緑色蛍光タンパク質を融合したVWF-mGreenLanternノックインマウス等の作製も開始したが、思いのほか難航し、現時点でまだ目的のマウスを得られていない。その原因は不明であるが、解決策として短鎖ペプチドタグ配列を融合したVWF-HAノックインマウスおよびVWF-V5ノックインマウスの作製を試み、樹立に成功した。これと並行して、心内膜細胞におけるVWFの解析に着手した。まず、野生型マウスおよびVWF欠損マウスを用いて免疫組織化学的解析を行った結果、野生型マウスの心内膜において抗VWF抗体に対する特異的染色が観察された。次に、マウス心内膜細胞の単離を試みた。開始前はラットやブタでの既存の単離方法の小変更で実施可能と予想していたが、実際にはラット比1/20程度のサイズのマウス心臓では非常に困難であることが分かった。そこで現在、心内膜細胞以外の細胞の遊離を最大限に抑えるための酵素液暴露方法や酵素の種類等の検討を進めている。

今後の研究の推進方策

作製したタグ融合VWFマウスを利用してVWFの解析を進める。そのために、マウスの血管内皮細胞・心内膜細胞を培養し、平常時や感染時等のVWFの動態を調べる。血管内皮細胞は大動脈から単離するか、血液中のendothelial colony forming cells（ECFC）を単離培養する。さらに、個体レベルの解析も行う。VWFは主に血管内皮細胞で産生されるが、一部は巨核球や心内膜細胞で発現する。血栓形成に使用されるVWFとして、血漿VWF（血管内皮／心内膜細胞から恒常分泌？）、血管内皮細胞から緊急分泌されたVWF、血小板活性化で放出されたVWFなどが想定されるが、どのVWFがどの段階で止血に寄与するのかは謎である。本研究で作製する複数種のタグ融合VWFマウスを活用し、血栓形成におけるVWFの起源と役割の関連を明らかにする。これらのマウスを用いた骨髄移植実験も行う。一方、心内膜VWFの意義を明らかにするため、今後も引き続き、心内膜細胞単離方法の検討を進める。マウス心内膜細胞の単離方法が確立できれば、心内膜研究にとって有用である。また、心内膜細胞に発現するVWFの性状（マルチマー様式や血小板結合性など）についても検討する予定である。そのためにはVWF供給源として知られる血管内皮細胞および巨核球／血小板由来のVWFを用いた比較解析が有効であると考えている。心内膜細胞に発現するVWFの特異的機能を知るため、心内膜細胞と血管内皮細胞それぞれのWeibel-Palade小体（WPB）に含まれる因子の比較やVWF相互作用タンパク質の同定などを進めたい。

研究成果

• [雑誌論文] Mitral regurgitation is associated with similar loss of von Willebrand factor large multimers, but less anemia as compared to aortic stenosis (2024)
  • 著者名/発表者名: Takiguchi、Miura、Shirai、Soga、Hanyu、Sakaguchi、Soga、Arai、Watanabe、Kimura、Takahama、Yasuda、Nakayoshi、Fukumoto、Yaoita、Shimokawa、Sakatsume、Saiki、Kaikita、Tsujita、Tamura、Doman、Yamashita、Suzuki、Eura Yuka、Kokame Koichi、Hayakawa、Matsumoto、Okubo、Sugawara、Fujimaki、Kawate、Ando、Horiuchi
  • 雑誌名: Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis 巻: 8 号: 4 ページ: 102431-102431
  • DOI: 10.1016/j.rpth.2024.102431
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 新生児期より血小板減少を反復し成人になって診断された先天性血栓性血小板減少性紫斑病 (2024)
  • 著者名/発表者名: 吉野明久、松本雅則、衛藤徹也、谷口修一、栗山拓郎、内海紗江、嶋川卓史、南満理子、林正康、松尾弥生、小亀浩市、中村恵理子
  • 雑誌名: 臨床血液 巻: 65 号: 3 ページ: 142-146
  • DOI: 10.11406/rinketsu.65.142
  • ISSN: 0485-1439, 1882-0824
  • 査読あり
• [雑誌論文] von Willebrand factor Ristocetin co-factor activity to von Willebrand factor antigen level ratio for diagnosis of acquired von Willebrand syndrome caused by aortic stenosis (2024)
  • 著者名/発表者名: Okubo N, Sugawara S, Fujiwara T, Sakatsume K, Doman T, Yamashita M, Goto K, Tateishi M, Suzuki M, Shirakawa R, Eura Y, Kokame K, Hayakawa M, Matsumoto M, Kawate Y, Miura M, Takiguchi H, Soga Y, Shirai S, Ando K, Arai Y, Nakayoshi T, Fukumoto Y, Takahama H, Yasuda S, Tamura T, Watanabe S, Kimura T, et al
  • 雑誌名: Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis 巻: 8 号: 1 ページ: 102284-102284
  • DOI: 10.1016/j.rpth.2023.102284
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Diagnostic and treatment guidelines for thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) in Japan 2023 (2023)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto Masanori、Miyakawa Yoshitaka、Kokame Koichi、Ueda Yasunori、Wada Hideo、他
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 118 号: 5 ページ: 529-546
  • DOI: 10.1007/s12185-023-03657-0
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 血栓性血小板減少性紫斑病診療ガイド2023 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松本雅則、宮川義隆、小亀浩市、上田恭典、和田英夫、日笠聡、八木秀男、小川孔幸、酒井和哉、宮田敏行、森下英理子、藤村吉博
  • 雑誌名: 臨床血液 巻: 64 号: 6 ページ: 445-460
  • DOI: 10.11406/rinketsu.64.445
  • ISSN: 0485-1439, 1882-0824
  • 査読あり
• [学会発表] Long range PCRを用いたロングリードシーケンシングのフェージング攻略法 (2023)
  • 著者名/発表者名: 樋口(江浦)由佳、叶盛、松本雅則、小亀浩市
  • 学会等名: 第69回日本生化学会近畿支部例会
• [学会発表] プロテインＳとTAM受容体を介した血管内皮細胞における血液脳関門保護機能 (2023)
  • 著者名/発表者名: 秋山正志、Teena Bhakuni、小亀浩市
  • 学会等名: 第69回日本生化学会近畿支部例会
• [学会発表] ロングリードのターゲットシーケンシングと全ゲノムシーケンシングを併用したADAMTS13遺伝子解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 樋口(江浦)由佳、叶盛、松本雅則、小亀浩市
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] VWF遺伝子解析の困難性を克服するロングリードシーケンシング法の構築 (2023)
  • 著者名/発表者名: 叶盛、樋口(江浦)由佳、松本雅則、小亀浩市
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] プロテインＳ遺伝子のイントロン１に同定した転写調節領域の機能解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 丸山慶子、小亀浩市
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] Weibel-Palade小体の形成過程で内腔はV-ATPaseにより酸性化される (2023)
  • 著者名/発表者名: 山崎泰男、小亀浩市
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 大動脈弁狭窄症に随伴する後天性フォンヴィレブランド症候群の診断におけるVWF:RCo/VWF:Agの有用性についての検討 (2023)
  • 著者名/発表者名: 堀内久徳、大久保礼由、菅原新吾、藤原亨、樋口(江浦)由佳、小亀浩市、早川正樹、松本雅則、川手康徳、藤巻慎一
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 大動脈弁狭窄症症例における凝固第VIII因子活性とフォンヴィレブランド因子活性（VWF:RCo）、抗原量（VWF:Ag）の関係についての検討 (2023)
  • 著者名/発表者名: 堀内久徳、大久保礼由、菅原新吾、藤原亨、樋口(江浦)由佳、小亀浩市、早川正樹、松本雅則、川手康徳、藤巻慎一
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] Comparison of VWF:RCo/VWF:Ag ratios with the VWF large multimer indices in patients with aortic stenosis (2023)
  • 著者名/発表者名: Hisanori Horiuchi, Noriyuki Okubo, Shingo Sugawara, Tohru Fujiwara, Yuka Eura, Koichi Kokame, Masaki Hayakawa, Masanori Matsumoto, Yasunori Kawate, Shin-ichi Fujimaki
  • 学会等名: The 31st Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis
  • 国際学会