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機能改変酵素を用いた真菌細胞壁多糖構造プロファイリング技術の基盤開発

研究課題

研究課題/領域番号 23K27411
補助金の研究課題番号 23H02720 (2023)
研究種目

基盤研究(B)

配分区分基金 (2024)
補助金 (2023)
応募区分一般
審査区分 小区分49050:細菌学関連
研究機関東京薬科大学

研究代表者

山中 大輔  東京薬科大学, 薬学部, 講師 (70734599)

研究分担者 木村 将大  東京工科大学, 応用生物学部, 助教 (80910215)
安達 禎之  東京薬科大学, 薬学部, 教授 (60222634)
研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2027-03-31
研究課題ステータス 交付 (2024年度)
配分額 *注記
18,980千円 (直接経費: 14,600千円、間接経費: 4,380千円)
2026年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2025年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
2024年度: 5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円)
2023年度: 8,320千円 (直接経費: 6,400千円、間接経費: 1,920千円)
キーワード真菌 / 細胞壁 / 多糖 / 糖質加水分解酵素
研究開始時の研究の概要

病原性真菌の細胞壁多糖合成系は抗真菌薬の標的となり、多糖は真菌感染症の診断バイオマーカーとしても利用されるため、真菌多糖の構造情報の取得は感染制御に繋がる。本研究では、糖質加水分解酵素の機能改変によって多糖に特異的に結合する人工タンパク質プローブを多数開発し、これらを組み合わせた多糖構造の網羅的プロファイリング技術の創出を目指す。

研究実績の概要

本研究課題は、糖質加水分解酵素を利用して真菌細胞壁を構成する様々な多糖類に対する特異的結合タンパク質の創出を目指すものである。2023年度には、多くの病原性真菌の細胞壁に共通して存在するβ-1,3-グルカンを特異的かつ高感度に検出する目的で、糖質加水分解酵素の改変体を設計し、大腸菌を用いて発現させた。様々な酵素に由来する改変体の機能を評価し、真菌由来β-1,3-グルカンに対し強い結合を示す候補を選出した。得られた一部の候補タンパク質を、各種機能性ペプチドタグと融合し、β-1,3-グルカン存在下でのみ発光を示すホモジニアス測定法を構築した。最も結合活性の高い改変型酵素を用いた測定法では、pg/mLレベルのβ-グルカン定量が可能となり、カンジダ菌の培養上清からもβ-1,3-グルカンシグナルを検出することに成功した。また、特定の病原性真菌細胞壁に存在するα-1,3-グルカンに対する特異的結合タンパク質を獲得するために、複数の糖質加水分解酵素の改変体を設計し、大腸菌で発現させた。一部の改変体が真菌α-1,3-グルカンに対する結合を示したため、そのうち最も強い結合活性を持つ改変体の機能を詳細に解析し、この改変体がα-1,3-グルカン以外の真菌多糖とは結合しないことを確認した。この候補タンパク質に、各種機能性ペプチドタグを融合することで、α-1,3-グルカン特異的な検出法を構築するに至った。いずれの候補タンパク質も標的多糖に対する結合特異性が高いため、真菌の病原性を左右する細胞壁多糖の構造解析に適したタンパク質プローブとしての応用が期待できる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

タンパク質の発現工程及び機能解析のプロトコルをさらに効率化し、発現から精製、簡易解析を終えるまでの期間を大幅に短縮した。設計した多くの酵素改変体はグルカンとの強い結合活性を示さなかったが、得られた一部の候補タンパク質を応用することで、2種類のグルカン構造を特異的に検出する手法を開発するに至った。一方、その他の多糖構造に対する結合タンパク質の開発にも着手しており、多数の酵素改変体の発現・機能評価を進めている。従って、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。

今後の研究の推進方策

引き続き、糖質加水分解酵素をもとに、真菌多糖に特異的に結合するタンパク質プローブの開発を進める。また、2023年度に得られた各種グルカン結合タンパク質候補の結合活性を向上させる検討を進め、検出感度の向上を試みる。

報告書

(1件)
  • 2023 実績報告書
  • 研究成果

    (9件)

すべて 2024 2023

すべて 学会発表 (8件) (うち招待講演 2件) 産業財産権 (1件)

  • [学会発表] 真菌可溶性β-グルカンの暴露がヒト単球様細胞の抗真菌応答に及ぼす影響2024

    • 著者名/発表者名
      田中 恵太郎、山中 大輔、安達 禎之
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 機能改変型糖質加水分解酵素を用いたβ-1,3-グルカン特異的定量法の開発2024

    • 著者名/発表者名
      籠田 よしの、山中 大輔、鈴木 健斗、安達 禎之
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 真菌細胞壁β-1,6-グルカンはヒト単球様細胞のDectin-1応答をグルコース依存的に増幅させる2024

    • 著者名/発表者名
      米山 優香、山中 大輔、安達 禎之
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 糖質加水分解酵素の機能改変による真菌細胞壁α-1,3-グルカン特異的結合プローブの開発2024

    • 著者名/発表者名
      鈴木 健斗、山中 大輔、木村 将大、安達 禎之
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 血清および単球様細胞と混合した真菌細胞壁の多糖構造解析2023

    • 著者名/発表者名
      山中 大輔、安達 禎之
    • 学会等名
      第67回日本医真菌学会総会・学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 機能改変酵素を用いた多糖の高感度検出法と簡易構造解析法の開発2023

    • 著者名/発表者名
      山中 大輔、安達 禎之
    • 学会等名
      第96回日本生化学会大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 糖質加水分解酵素の機能改変によるβ-グルカン特異的結合プローブの開発2023

    • 著者名/発表者名
      籠田 よしの、山中 大輔、鈴木 健斗、安達 禎之
    • 学会等名
      2023年日本細菌学会関東支部インターラボセミナー
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 糖質加水分解酵素を応用したβ-グルカンの構造解析2023

    • 著者名/発表者名
      山中 大輔
    • 学会等名
      2023年日本細菌学会関東支部インターラボセミナー
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [産業財産権] α-1,3-グルカン結合ポリペプチド、α-1,3-グルカンの検出方法、α-1,3-グルカン検出キット、組換え微生物または細胞2023

    • 発明者名
      山中大輔、鈴木健斗
    • 権利者名
      学校法人東京薬科大学
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      2023-204264
    • 出願年月日
      2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書

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公開日: 2023-04-18   更新日: 2024-12-25  

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