B型肝炎ウイルス細胞侵入機構とその制御に関する構造生物学研究

• 研究課題/領域番号: 23K27415
• 補助金の研究課題番号: 23H02724 (2023)
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 基金 (2024); 補助金 (2023)
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分49060:ウイルス学関連
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 野村 紀通 京都大学, 医学研究科, 准教授 (10314246)
• 研究分担者: 渡士 幸一 国立感染症研究所, 治療薬・ワクチン開発研究センター, 総括研究官 (40378948)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円); 2025年度: 6,110千円 (直接経費: 4,700千円、間接経費: 1,410千円); 2024年度: 6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円); 2023年度: 6,110千円 (直接経費: 4,700千円、間接経費: 1,410千円)
• キーワード: ウイルス受容体 / エンベロープタンパク質 / クライオ電子顕微鏡 / 宿主因子 / B型肝炎ウイルス / 感染受容体 / クライオ電子顕微鏡単粒子解析 / 宿主ーウイルス相互作用 / 抗ウイルス薬

研究開始時の研究の概要

C型肝炎がほぼ克服された一方で、B型肝炎ウイルス (HBV) の感染を原因としたB型肝炎は依然として公衆衛生上の主要な問題である。簡便に投与可能なHBV感染抑制薬を開発することにより肝炎罹患の根本原因に歯止めをかけることが強く望まれる。本研究では、① HBV細胞侵入超分子複合体の形成メカニズム、②次世代HBV感染抑制薬シーズ化合物群の作用機序を、クライオ電子顕微鏡を用いて構造学的に解明する。

研究実績の概要

B型肝炎ウイルス(HBV)感染の成立には、エンベロープタンパク質LHBs(large hepatitis B virus surface antigen)と、ヒト肝細胞表面にあり感染受容体として機能するナトリウム・タウロコール酸共輸送ポリペプチド（NTCP)との高親和性の結合が必須である。これまでのウイルス学研究から、LHBsのN末端の脂質修飾（N-ミリストイル化）とそれに続くN末端側47残基のペプチド部分(preS1)がNTCPとの結合において重要であることがわかっている。
本年度の研究においてNTCP-preS1複合体のクライオ電子顕微鏡構造解析に成功した。preS1は溶液中では特定の構造をもたない柔軟性に富むペプチド部分から成ると考えられていたが、NTCPと結合した状態ではN末端側約20残基部分がコンパクトに折り畳まれてNTCP内部の中央キャビティに深く入り込むことが明らかになった。preS1のN末端に存在するミリストイル基（脂質修飾）はNTCPの外側表面の脂質膜にアンカーされることも観察された。
構造解析および胆汁酸輸送試験の結果、preS1はNTCPの胆汁酸輸送経路を構成する中央キャビティを占有することで、胆汁酸の結合および輸送を競合的に阻害することが明らかになった。NTCPのpreS1結合部位と胆汁酸結合部位の多くは共通していたが、NTCPの細胞外側表面のループ領域や膜貫通ヘリックスTM8bの一部はpreS1との結合に関わるものの、胆汁酸の輸送経路には重ならないことが示唆された。したがって、これらの限定的な領域に特異的に結合する化合物を探索することにより、NTCPの胆汁酸輸送機能を維持しつつ、preS1の結合のみを抑制できる次世代抗HBV薬の創出につながることが期待される。本研究成果は、構造情報に基づく合理的な抗ウイルス薬の分子設計に新たな道筋を拓くものである。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

C型肝炎がほぼ克服された一方で、B型肝炎ウイルス(HBV)の感染を原因としたB型肝炎は依然として公衆衛生上の主要な問題である。慢性B型肝炎は肝硬変や肝細胞がんを引き起こし、全世界で年間90万人が死亡している。また、国内では近年 genotype A（欧米型）のHBV感染による急性B型肝炎が大都市部で急速に増加している。有効かつ簡便に投与可能なHBV感染抑制薬を開発することにより肝炎罹患の根本原因に歯止めをかけることが強く望まれる。HBVエンベロープと感染受容体NTCPの間に形成される相互作用はHBV感染制御の観点から重要な創薬ターゲットであり、高精度可視化が長年待望されていた。
研究開始から１年に満たない期間で、NTCPとpreS1の分子間相互作用を原子レベルで解像することに世界で初めて成功した。HBVが宿主肝細胞表面に高親和性で付着する分子機構を解明し、感染制御・抗ウイルス薬開発の基盤を築いた。本成果はNature Structural & Molecular Biology誌にて発表した。以上から、「当初の計画以上に進展している」と自己評価した。

今後の研究の推進方策

①HBV細胞侵入超分子複合体の構成因子同定・試験管内再構成とクライオ電子顕微鏡構造解析
光作動性タンパク質化学架橋法を用いて、LHBs-NTCPと相互作用する宿主因子を捕捉する。培養細胞NTCP-HepG2に、DiazirineでケミカルラベルしたHBV粒子を添加し、ウイルス感染後のさまざまな光照射タイミングで宿主侵入共役因子を架橋する。化学架橋反応産物を細胞膜から可溶化してビオチンアフィニティー精製後、質量分析によりタンパク質種を特定する。候補因子群のshRNAによるノックダウン、またはCRISR-Casによるノックアウトを実施し、HBV感染モデル実験における表現型、感染の成立・不成立を解析する。以上の結果を総合して、HBV細胞侵入超分子複合体の構成因子を解明する。また、超分子複合体をin vitro再構成後、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を行う。因子間の相互作用様式を解明し、新たなHBV感染抑制薬の標的を見出す。

②HBV感染阻害活性をもつ中分子医薬シーズの作用機序の構造学的解明
HBV感染抑制薬の開発において考慮すべき点は、感染受容体であるNTCPは胆汁酸の腸肝循環を担うトランスポーターでもある点である。分担者らは、NTCPの胆汁酸輸送活性を阻害せずにウイルス吸着のみを特異的に阻害するシクロスポリン誘導体や特殊環状ペプチドを同定・報告しており (Shimura et al., J. Hepatol., 2017; Passioura et al., Cell Chem. Biol., 2018)、副作用の少ない優れた抗HBV薬候補になると期待されている。これらがNTCPとどのように相互作用するのかをクライオ電子顕微鏡単粒子解析により解明する。得られた構造をNTCP-preS1複合体構造と重ね合わせることによって、感染阻害剤としての作用機序を検証する。

研究成果

• [国際共同研究] Stockholm University(スウェーデン)
• [雑誌論文] Structural basis of hepatitis B virus receptor binding (2024)
  • 著者名/発表者名: Asami Jinta、Park Jae-Hyun、Nomura Yayoi、Kobayashi Chisa、Mifune Junki、Ishimoto Naito、Uemura Tomoko、Liu Kehong、Sato Yumi、Zhang Zhikuan、Muramatsu Masamichi、Wakita Takaji、Drew David、Iwata So、Shimizu Toshiyuki、Watashi Koichi、Park Sam-Yong、Nomura Norimichi、Ohto Umeharu
  • 雑誌名: Nature Structural & Molecular Biology 巻: 31 号: 3 ページ: 447-454
  • DOI: 10.1038/s41594-023-01191-5
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Mpox Neutralizing Antibody Response to LC16m8 Vaccine in Healthy Adults (2024)
  • 著者名/発表者名: Morino E, Mine S, Tomita N, Uemura Y, Shimizu Y, Saito S, Suzuki T, Okumura N, Iwasaki H, Terada J, Ainai A, Sakai Y, Park E, Seki S, Akazawa D, Shimojima M, Shiwa-Sudo N, Virhuez-Mendoza M, Miyauchi K, Moriyama S, Iwata-Yoshikawa N, Harada M, Harada S, Hishiki T, ... Ujiie M.
  • 雑誌名: NEJM Evidence 巻: 3 号: 3
  • DOI: 10.1056/evidoa2300290
  • 査読あり
• [雑誌論文] Synthesis of the full-length hepatitis B virus core protein and its capsid formation (2024)
  • 著者名/発表者名: Aoki Keisuke、Tsuda Shugo、Ogata Naoko、Kataoka Michiyo、Sasaki Jumpei、Inuki Shinsuke、Ohno Hiroaki、Watashi Koichi、Yoshiya Taku、Oishi Shinya
  • 雑誌名: Organic &; Biomolecular Chemistry 巻: 22 号: 11 ページ: 2218-2225
  • DOI: 10.1039/d3ob02099a
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Harnessing a T1 Phage-Derived Spanin for Developing Phage-Based Antimicrobial Development (2024)
  • 著者名/発表者名: Yamashita Wakana、Ojima Shinjiro、Tamura Azumi、Azam Aa Haeruman、Kondo Kohei、Yuancheng Zhang、Cui Longzhu、Shintani Masaki、Suzuki Masato、Takahashi Yoshimasa、Watashi Koichi、Tsuneda Satoshi、Kiga Kotaro
  • 雑誌名: BioDesign Research 巻: 6 ページ: 0028-0028
  • DOI: 10.34133/bdr.0028
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Multiscale modeling of HBV infection integrating intra- and intercellular viral propagation to analyze extracellular viral markers (2024)
  • 著者名/発表者名: Kitagawa Kosaku、Kim Kwang Su、Iwamoto Masashi、Hayashi Sanae、Park Hyeongki、Nishiyama Takara、Nakamura Naotoshi、Fujita Yasuhisa、Nakaoka Shinji、Aihara Kazuyuki、Perelson Alan S.、Allweiss Lena、Dandri Maura、Watashi Koichi、Tanaka Yasuhito、Iwami Shingo
  • 雑誌名: PLOS Computational Biology 巻: 20 号: 3 ページ: 1011238-1011238
  • DOI: 10.1371/journal.pcbi.1011238
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cryo-EM structures of human zinc transporter ZnT7 reveal the mechanism of Zn2+ uptake into the Golgi apparatus (2023)
  • 著者名/発表者名: Bui Han Ba、Watanabe Satoshi、Nomura Norimichi、Liu Kehong、Uemura Tomoko、Inoue Michio、Tsutsumi Akihisa、Fujita Hiroyuki、Kinoshita Kengo、Kato Yukinari、Iwata So、Kikkawa Masahide、Inaba Kenji
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 14 号: 1 ページ: 4770-4770
  • DOI: 10.1038/s41467-023-40521-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structure and mechanism of oxalate transporter OxlT in an oxalate-degrading bacterium in the gut microbiota (2023)
  • 著者名/発表者名: Jaunet-Lahary Titouan、Shimamura Tatsuro、Hayashi Masahiro、Nomura Norimichi、Hirasawa Kouta、Shimizu Tetsuya、Yamashita Masao、Tsutsumi Naotaka、Suehiro Yuta、Kojima Keiichi、Sudo Yuki、Tamura Takashi、Iwanari Hiroko、Hamakubo Takao、Iwata So、Okazaki Kei-ichi、Hirai Teruhisa、Yamashita Atsuko
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 14 号: 1 ページ: 1730-1730
  • DOI: 10.1038/s41467-023-36883-5
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] B型肝炎ウイルスの感染受容体NTCPの構造 (2023)
  • 著者名/発表者名: 野村紀通
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 巻: 285 ページ: 1082-1083
• [雑誌論文] An ACAT inhibitor regulates SARS-CoV-2 replication and antiviral T cell activity (2023)
  • 著者名/発表者名: Nathalie M Schmidt, Rory Peters, Rachel Brown, Hao Wang, Leo Swadling, COVIDsortium Investigators, Joseph Newman, Nazia Thakur, Kaho Shionoya, Sophie B Morgan, Timothy SC Hinks, Koichi Watashi, Dalan Bailey, Scott B Hansen, Mala K Maini, Jane A McKeating
  • 雑誌名: PLoS Pathog 巻: 3 号: 5 ページ: e1011323-e1011323
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1011323
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Selective inhibition of hepatitis B virus internalization by oxysterol derivatives (2023)
  • 著者名/発表者名: Oshima Mizuki、Stappenbeck Frank、Ohashi Hirofumi、Iwamoto Masashi、Fukano Kento、Kusunoki Atsuto、Zheng Xin、Wang Feng、Morishita Ryo、Aizaki Hideki、Suzuki Ryosuke、Muramatsu Masamichi、Kuramochi Kouji、Sureau Camille、Parhami Farhad、Watashi Koichi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 675 ページ: 139-145
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2023.07.014
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Hepatocellular organellar abnormalities following elimination of hepatitis C virus (2023)
  • 著者名/発表者名: Aoyagi H, Iijima H, Gaber ES, Zaitsu T, Matsuda M, Wakae K, Watashi K, Suzuki R, Masaki T, Kahn J, Saito T, El-Kassas M, Shimada N, Kato K, Enomoto M, Hayashi K, Tsubota A, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Muramatsu M, Wake K, Wakita T, Aizaki H
  • 雑誌名: Liver International 巻: 43 号: 8 ページ: 1677-1690
  • DOI: 10.1111/liv.15624
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Identification of IMP Dehydrogenase as a Potential Target for Anti-Mpox Virus Agents (2023)
  • 著者名/発表者名: Hishiki T、Morita T、Akazawa D、Ohashi H、Park E、Kataoka M、Mifune J、Shionoya K、Tsuchimoto K、Ojima S、Azam Aa H、Nakajima S、Kawahara M、Yoshikawa T、Shimojima M、Kiga K、Maeda K、Suzuki T、Ebihara H、Takahashi Y、Watashi K.
  • 雑誌名: Microbiology Spectrum 巻: 11 号: 4
  • DOI: 10.1128/spectrum.00566-23
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A versatile method to profile hepatitis B virus DNA integration (2023)
  • 著者名/発表者名: Fukano Kento、Wakae Kousho、Nao Naganori、Saito Masumichi、Tsubota Akihito、Toyoshima Takae、Aizaki Hideki、Iijima Hiroko、Matsudaira Takahiro、Kimura Moto、Watashi Koichi、Sugiura Wataru、Muramatsu Masamichi
  • 雑誌名: Hepatology Communications 巻: 7 号: 12
  • DOI: 10.1097/hc9.0000000000000328
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Potential Anti-Mpox Virus Activity of Atovaquone, Mefloquine, and Molnupiravir, and Their Potential Use as Treatments (2023)
  • 著者名/発表者名: Akazawa D、Ohashi H、Hishiki T、Morita T、Iwanami S、Kim KS、Jeong YD、Park ES、Kataoka M、Shionoya K、Mifune J、Tsuchimoto K、Ojima S、Azam AH、Nakajima S、Park H、Yoshikawa T、Shimojima M、Kiga K、Iwami S、Maeda K、Suzuki T、Ebihara H、Takahashi Y、Watashi K
  • 雑誌名: The Journal of Infectious Diseases 巻: Online ahead of print. 号: 5 ページ: 591-603
  • DOI: 10.1093/infdis/jiad058
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Oxidative stress sensor Keap1 recognizes HBx protein to activate the Nrf2/ARE signaling pathway, thereby inhibiting hepatitis B virus replication (2023)
  • 著者名/発表者名: Ariffianto Adi、Deng Lin、Abe Takayuki、Matsui Chieko、Ito Masahiko、Ryo Akihide、Aly Hussein Hassan、Watashi Koichi、Suzuki Tetsuro、Mizokami Masashi、Matsuura Yoshiharu、Shoji Ikuo
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 97 号: 10 ページ: 1-35
  • DOI: 10.1128/jvi.01287-23
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A Multicenter Randomized Controlled Trial To Evaluate the Efficacy and Safety of Nelfinavir in Patients with Mild COVID-19 (2023)
  • 著者名/発表者名: Miyazaki T, Hosogaya N, Fukushige Y, Takemori S, Morimoto S, Yamamoto H, Hori M, Ozawa Y, Shiko Y, Inaba Y, Kurokawa T, Matsumoto T, Saito M, Yotsuyanagi H, Kohno S. et al.
  • 雑誌名: Microbiology Spectrum 巻: 11 号: 3 ページ: 4311-4322
  • DOI: 10.1128/spectrum.04311-22
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 胆汁酸トランスポーターNTCPによるB型肝炎ウイルス認識の構造基盤 (2023)
  • 著者名/発表者名: 浅見仁太*、朴在鉉、野村弥生、石本直偉士*、小林ちさ*、御舩淳紀、植村智子、劉紅、佐藤有美、村松正道、脇田隆字、Drew David、渡士幸一、岩田想、清水敏之、朴三用、野村紀通、大戸梅治
  • 学会等名: 日本薬学会第143年会
• [学会発表] 抗体を用いた膜タンパク質構造研究 (2023)
  • 著者名/発表者名: 野村紀通
  • 学会等名: 京都大学BINDS合同シンポジウム：オープンイノベーションから創薬へ 2023
  • 招待講演
• [備考] B型肝炎ウイルスが感染受容体に結合するしくみを解明
  • URL: https://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research-news/2024-01-18
• [備考] クライオ電子顕微鏡によりゴルジ体の亜鉛輸送体による亜鉛輸送機構の全容を解明
  • URL: https://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research-news/2023-08-29-2
• [備考] 尿路結石形成を防ぐ腸内細菌で働く鍵分子・シュウ酸輸送体の立体構造解明
  • URL: https://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research-news/2023-04-04
• [産業財産権] 皮膚筋炎又は間質性肺炎の患者の治療抵抗性の予測方法、及び当該方法に使用されるキット (2024)
  • 発明者名: 笹井蘭、笹井恒雄、野中元裕、野村紀通
  • 権利者名: 国立大学法人京都大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2024-015255
  • 出願年月日: 2024