分子標的薬による急性骨髄性白血病クローンの選択・耐性に関わる分子異常の解明と克服

• 研究課題/領域番号: 23K27624
• 補助金の研究課題番号: 23H02933 (2023)
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 基金 (2024); 補助金 (2023)
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分54010:血液および腫瘍内科学関連
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 清井 仁 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (90314004)
• 研究分担者: 石川 裕一 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (80721092)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 18,850千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 4,350千円); 2025年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円); 2024年度: 6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円); 2023年度: 7,020千円 (直接経費: 5,400千円、間接経費: 1,620千円)
• キーワード: 急性骨髄性白血病 / 分子標的薬 / 耐性クローン / クローン選択 / 分子異常

研究開始時の研究の概要

急性骨髄性白血病（AML）に対する分子標的薬の導入は治療成績の向上をもたらしているが、耐性クローンの存在は依然重要な臨床的課題であり、耐性克服のみならず、耐性出現前にAML細胞の根絶を得るための至適併用療法の確立が必要である。本研究は、我々が樹立したシングルセルバーコードラベル化細胞株やPDX治療モデルおよび標的薬治療後再発症例の経時的臨床検体を用いたマルチオミクス解析を実施することにより、耐性クローンの選択から増幅に関わる分子病態の変化過程を明らかにし、標的薬治療のアルゴリズム構築と耐性克服に繋がる治療標的となりうる分子基盤の解明を目指すものである。

研究実績の概要

難治性急性前骨髄球性白血病（APL）クローンの分子病態解明を目的として、JALSG APL212試験再発例、APL-PDXモデルにおける移植細胞、生着細胞の全エクソン解析、トランスクリプトーム解析を実施し、難治性APL細胞における分子異常の特徴を検討した。8例の初診時検体、3例の再発時検体から従来樹立が困難といわれていたAPL-PDXモデルを樹立した。このうち、継代が可能であった4例は、全例再発を来し、PML::RARA short-form、FLT3-ITD変異を有していた。また、初診/再発時ペア検体とAPL-PDXモデルでの解析により、再発時に認められた遺伝子変異を有するクローンが、APL-PDXモデルにおいて選択的に生着、増殖することが確認された。
様々な分子病型を有する難治性AML-PDXモデルを樹立し、抗がん剤、分子標的薬（FLT3阻害薬、Azacitidine、Venetoclax）の投与後に骨髄中に残存する治療抵抗性細胞を分離した。FLT3阻害剤長期投与後残存細胞におけるシングルセルRNA-Seq解析により、複数のFLT3阻害剤に共通して細胞接着分子とそのリガンド複合体の高発現が認められ、分子標的薬治療後の臨床検体においても同様の所見が得られたことから、治療抵抗性に関わる分子病態であることが強く示唆され、その分子メカニズムについて検討を進めている。 また樹立したPDX細胞にシングルセルバーコードを導入し、これまでに7例のDNAバーコード導入PDXモデルを樹立した。更に、RNAバーコード導入PDXモデルの樹立を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

初診時/再発時ペアAPL臨床検体とPDX生着APL細胞による解析から、APL-PDXモデルにおいても、他のＡＭＬと同様に再発/難治性クローンに認められる遺伝子異常を有するクローンが選択的に生着、増殖することを証明し、APLの難治性クローンの進展過程を解析する上での本モデルの有用性を確認した。この結果に基づき、シングルセルバーコードラベル化APL-PDXモデルに対して分子標的薬剤投与後の残存APL細胞の解析を行うことにより、難治性APLクローンの選択・進化過程を追跡する実験系の妥当性が証明された。
FLT3変異陽性AML-PDXモデルに対するFLT3阻害剤長期投与後に残存する治療抵抗性クローンにおけるシングルセルRNA-Seq解析の結果、複数のFLT3阻害剤に共通して発現亢進している分子を同定し、臨床的にFLT3阻害剤投与後再発を来したペア検体においても同様の所見が得られたことから、FLT3阻害剤耐性に関わる分子を同定できたと考えられる。現在、耐性機構に関わる分子機構を検証しており、耐性克服に向けた機構解明に繋がる成果が期待できる。
種々の分子異常を有するAML検体を用いたPDXモデルの作成を継続的に実施しており、それらAML-PDXモデルに対しBCL2阻害剤、脱メチル化剤などの投与後残存細胞の取得を進めると共に、シングルセルバーコードラベル化AML-PDXモデルの樹立も順調に進んでおり、当初予定の計画に沿って順調に進捗を認めている。

今後の研究の推進方策

APLにおけるクローン選択の解明
これまでに樹立したAPL-PDX細胞（PML-RARAにおけるATRA耐性変異が有るものと無いもの）について、シングルセルバーコードラベル化を行い、上記薬剤に加えて、ATRA、AM80、ATO 、IDR、CA、AZA、VENの投与を行い、投与後骨髄中に残存および再増殖を来したAPL細胞のクローン解析を細胞株と同様に行う。細胞株、PDXモデルでのATRA、AM80、ATO投与後の残存細胞の検討においては、分化誘導の有無を区別して解析するために、CD11bの発現を指標にソーティングを行った上で解析を進める。
FLT3遺伝子変異陽性AMLにおけるクローン選択の解明
シングルセルバーコードラベル化した変異FLT3発現32D細胞株を同型マウスC3Hに移植し、白血病を発症させたモデルに対し、FLT3阻害剤、VEN、DNR、CA、AZAを単独または併用投与を行い、残存および再増殖を来すクローンの分子病態をscRNA-Seqなどを用いて網羅的かつ経時的に解析する。本モデルでは、髄外腫瘤も形成されることが確認できているため、骨髄で増幅する難治性クローンと髄外腫瘤形成クローンとの比較解析も行う。移植モデルと同様の解析をシングルセルバーコードラベル化FLT3変異陽性AML-PDXを用いて解析する。初診時AML細胞由来PDXに加えて臨床的にGilteritinib耐性となったAML細胞由来のPDXモデルも樹立しており、これらを比較検討して解析を行う。
APL、FLT3変異陽性AML以外のAMLにおけるクローン選択の解明
樹立されているAML-PDXモデルに対し、VEN単独、およびAZA、CA、IDR、DNRとの併用投与後に残存する治療抵抗性AML細胞の解析を継続して進める。

研究成果

• [雑誌論文] Utility of allogeneic stem cell transplantation for adult Ph+ALL with complete molecular remission (2024)
  • 著者名/発表者名: Nishiwaki S, Sugiura I, Fujisawa S, Hatta Y, Atsuta Y, Doki N, Kurahashi S, Ueda Y, Dobashi N, Maeda T, Matsumura I, Tanaka M, Kako S, Ichinohe T, Fukuda T, Ohtake S, Ishikawa Y, Miyazaki Y, Kiyoi H
  • 雑誌名: American Journal of Hematology 巻: 99 号: 5 ページ: 806-815
  • DOI: 10.1002/ajh.27237
  • 査読あり
• [雑誌論文] Epstein-Barr virus lytic gene BNRF1 promotes B-cell lymphomagenesis via IFI27 upregulation (2024)
  • 著者名/発表者名: Sagou Ken、Sato Yoshitaka、Okuno Yusuke、Watanabe Takahiro、Inagaki Tomoki、Motooka Yashiro、Toyokuni Shinya、Murata Takayuki、Kiyoi Hitoshi、Kimura Hiroshi
  • 雑誌名: PLOS Pathogens 巻: 20 号: 2 ページ: e1011954-e1011954
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1011954
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Outcomes of transplant-eligible patients with myelodysplastic syndrome with excess blasts registered in an observational study: The JALSG-CS11-MDS-SCT (2024)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa N, Ishiyama K, Usuki K, Takada S, Tomikawa T, Handa H, Katsuoka Y, Hirano D, Sezaki N, Sumi M, Fujisawa S, Taniguchi Y, Mugitani A, Yoshimura T, Ohtsuka E, Takase K, Suehiro Y, Ota S, Kajiguchi T, Maeda T, Yamamoto M, Ohtake S, Katsumi A, Kiyoi H, Matsumura I, Miyazaki Y.
  • 雑誌名: Ann Hematol. 巻: 103 号: 1 ページ: 307-320
  • DOI: 10.1007/s00277-023-05527-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Suppression of super-enhancer-driven TAL1 expression by KLF4 in T-cell acute lymphoblastic leukemia (2023)
  • 著者名/発表者名: Noura Mina、Matsuo Hidemasa、Yasuda Takahiko、Tsuzuki Shinobu、Kiyoi Hitoshi、Hayakawa Fumihiko
  • 雑誌名: Oncogene 巻: 43 号: 6 ページ: 447-456
  • DOI: 10.1038/s41388-023-02913-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] Real-world data of MDS and CMML in Japan: results of JALSG clinical observational study-11 (JALSG-CS-11) (2023)
  • 著者名/発表者名: Usuki Kensuke、Ohtake Shigeki、Honda Sumihisa、Kojima Kensuke、Kiyoi Hitoshi、et al
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 119 号: 2 ページ: 130-145
  • DOI: 10.1007/s12185-023-03686-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] Real-world data of AML in Japan: results of JALSG clinical observational study-11 (JALSG-CS-11) (2023)
  • 著者名/発表者名: Usuki Kensuke、Ohtake Shigeki、Honda Sumihisa、Kojima Kensuke、Miyazaki Yasushi、et al
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 119 号: 1 ページ: 24-38
  • DOI: 10.1007/s12185-023-03677-w
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clonal hematopoiesis of a novel dic(18;20) clone following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (2023)
  • 著者名/発表者名: Ito Makoto、Fukushima Nobuaki、Fujii Tomoki、Numata Masaya、Morikawa Shiori、Kawamura Yuma、Goto Miyo、Kohno Akio、Imahashi Nobuhiko、Yasuda Takahiko、Sanada Masashi、Ishikawa Yuichi、Kiyoi Hitoshi、Ozeki Kazutaka
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 119 号: 1 ページ: 80-87
  • DOI: 10.1007/s12185-023-03673-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dual CAR-T Cells Targeting CD19 and CD37 Are Effective in Target Antigen Loss B-cell Tumor Models (2023)
  • 著者名/発表者名: Imai Kanae、Takeuchi Yuki、Terakura Seitaro、Okuno Shingo、Adachi Yoshitaka、Osaki Masahide、Umemura Koji、Hanajiri Ryo、Shimada Kazuyuki、Murata Makoto、Kiyoi Hitoshi
  • 雑誌名: Molecular Cancer Therapeutics 巻: 23 号: 3 ページ: 381-393
  • DOI: 10.1158/1535-7163.mct-23-0408
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeting cis-regulatory elements of FOXO family is a novel therapeutic strategy for induction of leukemia cell differentiation (2023)
  • 著者名/発表者名: Kurayoshi K, Takase Y, Ueno M, Ohta K, Fuse K, Ikeda S, Watanabe T, Nishida Y, Horike SI, Hosomichi K, Ishikawa Y, Tadokoro Y, Kobayashi M, Kasahara A, Jing Y, Shoulkamy MI, Meguro-Horike M, Kojima K, Kiyoi H, Sugiyama H, Nagase H, Tajima A, Hirao A.
  • 雑誌名: Cell Death Disease 巻: 14 号: 9 ページ: 642-642
  • DOI: 10.1038/s41419-023-06168-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Improved Long-Term Net Survival after Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation in Patients with Hematologic Malignancies over Two Decades (2023)
  • 著者名/発表者名: Ohbiki Marie、Ito Yuri、Inamoto Yoshihiro、Miyamura Koichi、Uchida Naoyuki、Fukuda Takahiro、Fujiwara Hiroki、Nishida Tetsuya、Hayashi Masayasu、Tanaka Masatsugu、Kawakita Toshiro、Ikegame Kazuhiro、Katayama Yuta、Ara Takahide、Ichinohe Tatsuo、Kiyoi Hitoshi、Matsuo Keitaro、Atsuta Yoshiko
  • 雑誌名: Transplantation and Cellular Therapy 巻: 29 号: 12 ページ: 768.e1-768.e10
  • DOI: 10.1016/j.jtct.2023.09.010
  • 査読あり
• [雑誌論文] Antibody response after third dose of COVID-19 mRNA vaccination in allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients is comparable to that in healthy counterparts (2023)
  • 著者名/発表者名: Takagi Erina、Terakura Seitaro、Fujigaki Hidetsugu、Okamoto Akinao、Miyao Kotaro、Sawa Masashi、Morishita Takanobu、Goto Tatsunori、Ozawa Yukiyasu、Nishida Tetsuya、Fukushima Nobuaki、Ozeki Kazutaka、Hanajiri Ryo、Saito Kuniaki、Murata Makoto、Tomita Akihiro、Kiyoi Hitoshi
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 118 号: 4 ページ: 462-471
  • DOI: 10.1007/s12185-023-03648-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-risk Combinations of Additional Chromosomal Abnormalities in Philadelphia Chromosome-positive Acute Lymphoblastic Leukemia: JALSG Ph+ALL TKI-SCT Study (2023)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa N, Ishiyama K, Usuki K, Takada S, Tomikawa T, Handa H, Katsuoka Y, Hirano D, Sezaki N, Sumi M, Fujisawa S, Taniguchi Y, Mugitani A, Yoshimura T, Ohtsuka E, Takase K, Suehiro Y, Ota S, Kajiguchi T, Maeda T, Yamamoto M, Ohtake S, Katsumi A, Kiyoi H, Matsumura I, Miyazaki Y.
  • 雑誌名: HemaSphere 巻: 7 号: 6 ページ: e899-e899
  • DOI: 10.1097/hs9.0000000000000899
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Autologous peripheral blood stem cell transplantation for Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia is safe but poses challenges for long-term maintenance of molecular remission: Results of the Auto-Ph17 study (2023)
  • 著者名/発表者名: Nishiwaki S, Sugiura I, Sato T, Kobayashi M, Osaki M, Sawa M, Adachi Y, Okabe M, Saito S, Morishita T, Kohno A, Nishiyama T, Iida H, Kurahashi S, Kuwatsuka Y, Sugiyama D, Ito S, Nishikawa H, Kiyoi H
  • 雑誌名: eJHaem 巻: - 号: 2 ページ: 358-369
  • DOI: 10.1002/jha2.677
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nelarabine, intensive L-asparaginase, and protracted intrathecal therapy for newly diagnosed T-cell acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults (ALL-T11): a nationwide, multicenter, phase 2 trial including randomisation in the very high-risk group (2023)
  • 著者名/発表者名: Sato Atsushi、Hatta Yoshihiro、Imai Chihaya、Oshima Koichi、Okamoto Yasuhiro、Deguchi Takao、Hashii Yoshiko、Fukushima Takashi、Hori Toshinori、Kiyokawa Nobutaka、Kato Motohiro、Saito Shoji、Anami Kenichi、Sakamoto Tatsuhiro、Kosaka Yoshiyuki、Suenobu Souichi、et al.
  • 雑誌名: The Lancet Haematology 巻: 10 号: 6 ページ: e419-e432
  • DOI: 10.1016/s2352-3026(23)00072-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] EBF1-JAK2 inhibits the PAX5 function through physical interaction with PAX5 and kinase activity. (2023)
  • 著者名/発表者名: Kojima Y, Kawashima F, Yasuda T, et al.
  • 雑誌名: Int J Hematol. 巻: in press 号: 1 ページ: 65-74
  • DOI: 10.1007/s12185-023-03585-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinicopathological characteristics associated with the engraftment of patient lymphoma cells in NOG mice (2023)
  • 著者名/発表者名: Sahashi Satomi、Shimada Kazuyuki、Takagi Yusuke、Aoki Tomohiro、Kunou Shunsuke、Sakamoto Akihiko、Murase Atsushi、Furukawa Katsuya、Kagaya Yusuke、Yamaga Yusuke、Takai Mika、Tokuyama Kiyonobu、Shimada Satoko、Nakamura Shigeo、Kiyoi Hitoshi
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 118 号: 2 ページ: 221-230
  • DOI: 10.1007/s12185-023-03604-z
  • 査読あり
• [学会発表] Development and Efficacy of a Novel Bromodomain and Extraterminal Domain Degrader K-256 in MYC/BCL2-Related Lymphoma (2023)
  • 著者名/発表者名: Furukawa, Kastuya; Shimada, Kazuyuki; Esaki, Masahiro; Tanaka, Kentaro; Yamamoto, Keisuke; Mori, Kiyotoshi; Kiyoi, Hitoshi
  • 学会等名: 65th Annual Meeting of the American-Society-of-Hematology (ASH)
  • 国際学会
• [学会発表] Suppression of Super-Enhancer-Driven TAL1 Expression By KLF4 in T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia (2023)
  • 著者名/発表者名: Noura, Mina; Yasuda, Takahiko; Tsuzuki, Shinobu; Matsuo, Hidemasa; Kiyoi, Hitoshi; Hayakawa, Fumihiko
  • 学会等名: 65th Annual Meeting of the American-Society-of-Hematology (ASH)
  • 国際学会
• [学会発表] Analysis of Metabolic Mechanism of CD19CAR-T with CD79A/CD40 Co-Stimulatory Domain Based on Comparison with Established CAR-Ts (2023)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi, Yuki; Terakura, Seitaro; Hirano, Shiho; Yokota, Hirofumi; Kuwano, Shihomi; Osaki, Masahide; Adachi, Yoshitaka; Imai, Kanae; Julamanee, Jakrawadee; Hanajiri, Ryo; Murata, Makoto; Kiyoi, Hitoshi
  • 学会等名: 65th Annual Meeting of the American-Society-of-Hematology (ASH)
  • 国際学会
• [学会発表] Refractory acute promyelocytic leukemia clones’ biological significance by patient-derived xenograft (2023)
  • 著者名/発表者名: Takashi Kurokawa, Yuichi Ishikawa, Yoko Ushijima, Naomi Kawashima, Satoshi Iwata, Seara Naruse, Jeong-Hui Kim, Marie Nakashima, Takahiro Nishiyama, Takanobu Morishita, Norihiro Ueda, Koichi Watamoto, Tetsuya Nishida, Kunio Kitamura, Hitoshi Kiyoi
  • 学会等名: 第85回日本血液学会学術集会
• [学会発表] The efficacy of BTK inhibitor in IVLBCL preclinical mouse models. (2023)
  • 著者名/発表者名: Takai, Mika; Shimada, Kazuyuki; Kiyoi, Hitoshi
  • 学会等名: 第82回日本癌学会学術総会