凍結乾燥したウシ精子ならびに二倍体細胞からの胚盤胞作製システム

• 研究課題/領域番号: 24580407
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用動物科学
• 研究機関: 信州大学
• 研究代表者: 保地 眞一 信州大学, 学術研究院繊維学系, 教授 (10283243)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円); 2015年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2014年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2013年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2012年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 凍結乾燥 / コラプス / α-ヘモリジン / トレハロース / ROCK阻害剤 / ビタミンE / 体細胞クローン / ICSI / SCNT / ケーキ / ウシ精子 / Tg' / 含水率 / 胚盤胞発生率 / αヘモリジン / ウシ顆粒膜細胞 / ケーキコラプス / DNA損傷 / アルカリコメットアッセイ / クローン胚盤胞 / フリーズドライ

研究成果の概要

本研究の目的はウシの精子や二倍体細胞のDNA損傷を可能な限り抑えた凍結乾燥 (FD) 条件を決定し、胚盤胞の量産システムを確立することである。以下の結果が得られた。(1) ヘモリジン変異体によるトレハロースの積極的導入はFD後の顆粒膜細胞のDNA損傷を抑制しなかった。(2) FDケーキが潰れる”コラプス”発生にはFDバッファーのTg’が関係し、トレハロース添加がTg’上昇とコラプス抑制に有効だった。(3) 未受精卵のガラス化・加温後の蘇生改善には回復培養液へのROCK阻害剤やαトコフェロールの添加が有効だった。(4) FD精子ならびにFD二倍体細胞に由来する胚盤胞の体外作出に成功した。

研究成果

• [国際共同研究] National Institute of Animal Science(韓国)
• [雑誌論文] Multiple aster formation is frequently observed in bovine oocytes retrieved from 1 day-stored ovaries (2016)
  • 著者名/発表者名: H. Hara, M. Tagiri, M. Hirabayashi & S. Hochi
  • 雑誌名: Zygote 巻: 24 号: 1 ページ: 115-120
  • DOI: 10.1017/s096719941400080x
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] HIgh incidence of polyspermic fertilization in bovine oocytes matured in vitro after cryotop vitrification (2016)
  • 著者名/発表者名: I-S. Hwang, D-J. Kwon, G-S. Im, K. Tashima, S. Hochi & S. Hwang
  • 雑誌名: Cryo Letters 巻: 37 ページ: 27-33
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] High revivability of vitrified-warmed bovine mature oocytes after recovery culture with α-tocopherol (2015)
  • 著者名/発表者名: Yashiro I, Tagiri M, Ogawa H, Tashima K, Takashima S, Hara H, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Reproduction 巻: 149 号: 4 ページ: 347-355
  • DOI: 10.1530/rep-14-0594
  • 査読あり
• [雑誌論文] Microtubule assembly and in vitro development of bovine oocytes with increased intracellular glutathione level prior to vitrification and in vitro fertilization (2014)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Yamane I, Noto I, Kagawa N, Kuwayama M, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Zygote 巻: 22 号: 4 ページ: 476-482
  • DOI: 10.1017/s0967199413000105
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Adverse effect of cake collapse on the functional integrity of freeze-dried bull spermatozoa (2014)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Tagiri M, Hwang IS, Takahashi M, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Cryobiology 巻: 68 号: 3 ページ: 354-360
  • DOI: 10.1016/j.cryobiol.2014.04.005
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Rescue of vitrified-warmed bovine oocytes with Rho-associated coiled-coil kinase inhibitor. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hwang IS, Hara H, Chung HJ, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Biology of Reproduction 巻: VOL.89 号: 2 ページ: 26-26
  • DOI: 10.1095/biolreprod.113.109769
  • 査読あり
• [雑誌論文] High incidence of multiple aster formation in vitrified-warmed bovine oocytes after in vitro fertilization (2012)
  • 著者名/発表者名: Hiromasa Hara
  • 雑誌名: Theriogenology 巻: 77 号: 5 ページ: 908-915
  • DOI: 10.1016/j.theriogenology.2011.09.018
  • 査読あり
• [学会発表] 卵丘細胞層ダウンサイズ後にガラス化保存した卵核胞期ウシ卵母細胞の蘇生能力 (2016)
  • 著者名/発表者名: 田島 和弥, 山中 貴寛, 佐藤 美月, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • 学会等名: 日本卵子学会
  • 発表場所: 朱鷺メッセ（新潟県新潟市）
  • 年月日: 2016-05-14
• [学会発表] GV期ウシ卵丘卵母細胞複合体の裸化処理が胚盤胞の体外作出に及ぼす影響 (2015)
  • 著者名/発表者名: 田島 和弥, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • 学会等名: 日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 宮崎大学（宮崎県宮崎市）
  • 年月日: 2015-09-17
• [学会発表] ウシの精子保存技術のこれまでとこれから (2015)
  • 著者名/発表者名: 保地 眞一.
  • 学会等名: 日本繁殖生物学会 市民公開講座「宇宙における動物繁殖の可能性」
  • 発表場所: 宮崎市民プラザ（宮崎県宮崎市）
  • 年月日: 2015-09-17
  • 招待講演
• [学会発表] ガラス化ウシ成熟卵母細胞の体外受精後に活性化補填することで胚盤胞発生率は改善できるか? (2015)
  • 著者名/発表者名: 田切 美穂, 八代 育子, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • 学会等名: 日本畜産学会
  • 発表場所: 宇都宮大学（栃木県宇都宮市）
  • 年月日: 2015-03-28 – 2015-03-30
• [学会発表] α-トコフェロール存在下におけるガラス化・加温したウシ成熟卵母細胞の回復培養 (2014)
  • 著者名/発表者名: 八代 育子, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • 学会等名: 日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 帯広畜産大学（北海道帯広市）
  • 年月日: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [学会発表] 保存卵巣由来のウシ前核期卵における星状体形成と胚盤胞発生との関係 (2014)
  • 著者名/発表者名: 原 弘真, 田切 美穂, 平林 真澄 & 保地 眞一
  • 学会等名: 日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 帯広畜産大学（北海道帯広市）
  • 年月日: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [学会発表] 保存卵巣由来のウシ前核期卵における星状体形成ならびにその後の胚盤胞発生に及ぼす短期ROCK阻害処理の影響 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田切 美穂, 原 弘真, 黄 仁偰, 八代 育子, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • 学会等名: 日本卵子学会
  • 発表場所: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2014-05-16 – 2014-05-18
• [学会発表] ガラス化ウシ成熟卵母細胞の回復培養液におけるビタミンC及びEの添加効果 (2014)
  • 著者名/発表者名: 八代 育子, 田切 美穂, 能登 一葉, 山根 伊織, 原 弘真, 保地 眞一.
  • 学会等名: 第118回日本畜産学会
  • 発表場所: つくば
• [学会発表] 黄色ブドウ球菌由来αヘモリジン変異体を用いてトレハロース導入したウシ顆粒膜細胞の凍結乾燥耐性 (2014)
  • 著者名/発表者名: 能登 一葉, 小林 あゆみ, 田切 美穂, 野村 隆臣, 保地 眞一.
  • 学会等名: 第118回日本畜産学会
  • 発表場所: つくば
• [学会発表] Effect of cake collapse on integrity of freeze-dried bull spermatozo (2014)
  • 著者名/発表者名: H. Hara, M. Tagiri, M. Hirabayashi, S. Hochi.
  • 学会等名: 第40回国際胚移植学会 (IETS)
  • 発表場所: レノ/ネバダ・USA
• [学会発表] Production of bovine blastocysts by nuclear transfer using freeze-dried fibroblast cells (2013)
  • 著者名/発表者名: K. Matsukawa, N. Kori, S. Hochi, S. Akagi, K. Edashige, M. Kasai, P. Loi.
  • 学会等名: 第46回北米生殖生物学会 (SSR)
  • 発表場所: ケベック/モントリオール・カナダ
• [学会発表] 成熟培養におけるROCK阻害が保存卵巣に由来するウシ卵母細胞の発生能に及ぼす影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 山根 伊織, 原 弘真, 平林 真澄, 保地 眞一.
  • 学会等名: 第117回日本畜産学会
  • 発表場所: 新潟
• [学会発表] ウシ繊維芽細胞の培養時期が細胞周期および凍結乾燥後のDNA損傷に与える影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 郡 七海, 枝重 圭祐, 葛西 孫三郎, 赤木 悟史, 保地 眞一, 松川 和嗣.
  • 学会等名: 第117回日本畜産学会
  • 発表場所: 新潟
• [学会発表] Rescue of vitrified-warmed bovine oocytes by recovery culture in the presence of Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor (2013)
  • 著者名/発表者名: 黄 仁偰, 八代 育子, 原 弘真, 平林 真澄, 保地 眞一.
  • 学会等名: 第106回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 府中
• [学会発表] 凍結乾燥ウシ精子の発生能に及ぼすコラプスの影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 原 弘真, 田切 美穂, 平林 真澄, 保地 眞一.
  • 学会等名: 第106回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 府中
• [学会発表] 凍結乾燥ケーキにおけるコラプス形成と復水ウシ精子の正常性との関係 (2013)
  • 著者名/発表者名: 原 弘真
  • 学会等名: 日本畜産学会第116回大会
  • 発表場所: 広島市
• [学会発表] ガラス化したウシ成熟卵母細胞の蘇生率は回復培養液へ添加したROCK阻害剤によって改善される (2013)
  • 著者名/発表者名: 八代 育子
  • 学会等名: 日本畜産学会第116回大会
  • 発表場所: 広島市
• [学会発表] 予備凍結および保存温度が凍結乾燥ウシ体細胞のDNA損傷および核移植後の発生に及ぼす影響 (2012)
  • 著者名/発表者名: 西本 あずさ
  • 学会等名: 日本繁殖生物学会第105回大会
  • 発表場所: つくば市
• [学会発表] ガラス化・加温したウシ体外成熟卵子における細胞内グルタチオン濃度と精子星状体形成および胚盤胞発生との関係 (2012)
  • 著者名/発表者名: 原 弘真
  • 学会等名: 日本繁殖生物学会第105回大会
  • 発表場所: つくば市
• [備考] 生殖工学研究室
  • URL: http://fiber.shinshu-u.ac.jp/hochi/index.html