広域分子量タンパク質群のリン酸化動態を追跡できるリン酸基親和性電気泳動ゲルの開発

• 研究課題/領域番号: 24590050
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 物理系薬学
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 木下 恵美子 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 助教 (40379912)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2014年度)
• 配分額: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円); 2014年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円); 2013年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円); 2012年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: リン酸基親和性電気泳動 / Phos-tag / フォスタグ / リン酸基親和性電気泳動法 / 亜鉛フォスタグ / タンパク質 / 分析化学 / リン酸化シグナル

研究成果の概要

本研究では申請者らが開発したリン酸基親和性電気泳動法(フォスタグSDS-PAGE)の原理を基盤として，高分子から低分子にわたる広い分子量範囲のタンパク質のリン酸化状態を解析できる技術の開発を行なった。
200kDa以下のタンパク質解析に適切なゲル緩衝液はBis-Tris-HCl（pH6.8），それ以上の分子量ではTris-acetate（pH7.0)が適切であると決定した。広範囲の分子量領域の様々な細胞内タンパク質のリン酸化解析を行ったデータを蓄積し，それをWebで公開できるように準備している。

研究成果

• [雑誌論文] The cutting edge of affinity electrophoresis technology (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Proteomes 巻: 3 号: 1 ページ: 42-55
  • DOI: 10.3390/proteomes3010042
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Neutral phosphate affinity SDS-PAGE system for profiling of protein phosphorylation (2015)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 雑誌名: Methods Mol. Biol. 巻: 1295 ページ: 323-354
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-2550-6_24
  • ISBN: 9781493925490, 9781493925506
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Simple enrichment of thiol- containing biomolecules by using zinc(II)-cyclen-functionalized magnetic beads (2014)
  • 著者名/発表者名: Fujioka, H., Tsunehiro, M., Kawaguchi, M., Kuramoto, Y., Kurosaki, H., Hieda, Y., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 雑誌名: J. Sep. Sci. 巻: 37 号: 13 ページ: 1601-1609
  • DOI: 10.1002/jssc.201400135
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A Phos-tag-based fluorescence quenching system for activity assay and inhibitor screening for alkaline phosphatase (2014)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Kurosaki, H., Kunisada, N., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 雑誌名: Am. J. Anal. Chem. 巻: 5 号: 12 ページ: 796-804
  • DOI: 10.4236/ajac.2014.512088
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Tips on improving the efficiency of electrotransfer of target proteins from Phos-tag SDS-PAGE gel (2014)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, Matsuda, A., and Koike, T.
  • 雑誌名: Proteomics 巻: 14 号: 21-22 ページ: 2437-2442
  • DOI: 10.1002/pmic.201400380
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of two phosphorylated species of β-catenin involved in the ubiquitin-proteasome pathway by using two- dimensional Phos-tag affinity electrophoresis (2014)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 雑誌名: J. Electrophoresis 巻: 58 ページ: 1-4
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Advances in Phos-tag-based methodologies for separation and detection of the phosphoproteome (2014)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta. 巻: 1854 ページ: 601-608
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] アフィニティー電気泳動技術の最前線 (2014)
  • 著者名/発表者名: 木下英司,木下恵美子,小池 透
  • 雑誌名: ぶんせき 巻: 7 ページ: 365-371
  • NAID: 40020143674
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Profiling of Protein Thiophosphorylation Using Phos-tag Affinity Electrophoresis: Evaluation of Adenosine 5′-O-(3-thiotriphosphate) as a Phosphoryl Donor in Protein Kinase Reactions (2014)
  • 著者名/発表者名: E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, A. Shiba, K. Edahiro, Y. Inoue, K. Yamamoto, and T. Koike
  • 雑誌名: Proteomics 巻: 14 号: 6 ページ: 668-679
  • DOI: 10.1002/pmic.201300533
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Phos-tag-based magnetic-bead method for rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules (2013)
  • 著者名/発表者名: M. Tsunehiro, Y. Meki, K. Matsuoka, E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita and T. Koike
  • 雑誌名: Journal of Chromatography B 巻: 925 ページ: 86-94
  • DOI: 10.1016/j.jchromb.2013.02.039
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sandwich assay for phosphorylation of protein multiplexes by using antibodies and Phos-tag (2013)
  • 著者名/発表者名: E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike
  • 雑誌名: Analytical Biochemistry 巻: 438 号: 2 ページ: 104-106
  • DOI: 10.1016/j.ab.2013.03.029
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increase in Lipophilicity of Enalaprilat by Complexation with Copper(II) or Zinc(II) Ions. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujioka, H., Hieda, Y., Kuramoto, Y, Konishi, K., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike T.
  • 雑誌名: Yakugaku Zasshi 巻: 33 ページ: 1135-1141
  • 査読あり
• [雑誌論文] タンパク質リン酸化修飾の高感度検出法と新しいオミクス技術としての展開． (2013)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 雑誌名: 生化学 巻: 85 ページ: 447-552
  • NAID: 10031184265
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phos-tag-Based Microarray Techniques Advance Phosphoproteomics (2013)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta and Tohru Koike
  • 雑誌名: Journal of Proteomics & Bioinformatics 巻: S6 号: S6 ページ: 8-8
  • DOI: 10.4172/jpb.s6-008
  • 査読あり
• [雑誌論文] Highly sensitive detection of protein phosphorylation by using improved Phos-tag Biotin (2012)
  • 著者名/発表者名: E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, Y. Sugiyama, Y. Fukada, T. Ozeki, and T. Koike
  • 雑誌名: Proteomics 巻: 12 号: 7 ページ: 932-937
  • DOI: 10.1002/pmic.201100639
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Laborsaving, Timesaving, and More Reliable Strategy for Separation of Low-Molecular-Mass Phosphoproteins in Phos-tag Affinity Electrophoresis (2012)
  • 著者名/発表者名: E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike
  • 雑誌名: International Journal of Chemistry 巻: 4 号: 5 ページ: 1-8
  • DOI: 10.5539/ijc.v4n5p1
  • 査読あり
• [学会発表] Phos-tag SDS-PAGEゲルからの標的タンパク質の転写効率を改善させる秘訣 (2014)
  • 著者名/発表者名: 木下英司,木下恵美子,小池透
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2014-11-25
• [学会発表] 銅および亜鉛キレート形成によるACE阻害剤エナラプリラトの脂溶性増加 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小西華那世,木下恵美子,木下英司,小池透
  • 学会等名: 第65回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2014-10-25
• [学会発表] SuperSep Phos-tag を用いた低分子量リン酸化タンパク質の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 脇本理恵子,木下恵美子,木下英司,小池透
  • 学会等名: 第65回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2014-10-25
• [学会発表] チオール含有生体分子を分 離・濃縮するための亜鉛サイクレン磁気ビーズの開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 河口真歩,Yuan Tianfei Elena,藤岡晴人,木下恵美子,木下英司,小池 透
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2014年会
  • 発表場所: つくば市
  • 年月日: 2014-07-18
• [学会発表] Phos-tag Biotin as an on-demand tool for study on protein phosphorylome.
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Phosphorylation profiling of MAPK signaling cascade proteins by using neutral Phos-tag SDS-PAGE
  • 著者名/発表者名: Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules by using a Phos-tag-based magneticbead method
  • 著者名/発表者名: Masaya Tsunehiro, Yuma Meki, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Quantitative analysis of effects of pH on the stability of His- and Asp-phosphoproteins in bacterial two-component system by using phosphate-affinity SDS-PAGE
  • 著者名/発表者名: Akio Shiba, Keisuke Edahiro, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Quantitative analysis of the phosphorylation state of a hybrid histidine kinase in bacterial twocomponent system by using phosphate-affinity SDS-PAGE
  • 著者名/発表者名: Keisuke Edahiro, Akio Shiba, Emiko Kinoshita-Kikuta, Yuki Inoue, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するための Phos-tag磁気ビーズの開発
  • 著者名/発表者名: 常弘 昌弥, 目木 勇馬, 木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] ヒスチジン，アスパラギン酸のタンパク質リン酸化解析におけるチオリン酸基供与体(ATP-gammaS)利用の有用性の検討
  • 著者名/発表者名: 芝 晃生，枝廣 圭祐，井上 裕希，木下 恵美子， 木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼにおけるリン酸基転移反応の制御機構解析
  • 著者名/発表者名: 枝廣 圭祐，芝 晃生，井上 裕希，木下 恵美子， 木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] 近接Phos-tagゲルを用いたリン酸化タンパク質の電気泳動法
  • 著者名/発表者名: 目木 勇馬，木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼにおけるリン酸基転移反応の制御機構解析
  • 著者名/発表者名: 枝廣圭祐, 芝 晃生, 井上裕希，木下恵美子, 木下英司，小池 透
  • 学会等名: 修飾シグナル病 第３回 公開シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所，東京
• [学会発表] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するためのPhos-tag磁気ビーズの創製
  • 著者名/発表者名: 常弘昌弥, 目木勇馬, 木下恵美子，木下英司, 小池 透
  • 学会等名: 修飾シグナル病 第３回 公開シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所，東京
• [学会発表] 亜鉛サイクレン磁気ビーズを用いたチオール化合物の精製
  • 著者名/発表者名: 藤岡晴人，稗田雄三，常弘昌弥，木下恵美子，木下英司，小池 透
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本市総合体育館，熊本市
• [学会発表] 中性Phos-tag SDS-PAGEを用いたタンパク質リン酸化反応の解析
  • 著者名/発表者名: 木下恵美子，木下英司，小池 透
  • 学会等名: 第85回日本生化学会
  • 発表場所: 福岡国際会議場 マリンメッセ福岡
• [学会発表] 中性Phos-tag SDS-PAGEを用いたヒスチジン，アスパラギン酸リン酸化タンパク質の解析
  • 著者名/発表者名: 芝 晃生，枝廣 圭祐，木下恵美子，木下英司，小池 透
  • 学会等名: 第85回日本生化学会
  • 発表場所: 福岡国際会議場 マリンメッセ福岡
• [学会発表] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離生成するためのPhos-tag磁気ビーズの創製
  • 著者名/発表者名: 常弘昌弥，目木勇馬，木下恵美子，木下英司，小池 透
  • 学会等名: 第85回日本生化学会
  • 発表場所: 福岡国際会議場 マリンメッセ福岡
• [学会発表] 中性亜鉛Phos-tagプレキャストゲル（ SuperSep Phos-tag ） を用いたリン酸化タンパク質の解析
  • 著者名/発表者名: 木下恵美子，木下英司，小池 透
  • 学会等名: 第63回日本電気泳動学会
  • 発表場所: 沖縄コンベンションセンター
• [学会発表] 中性Phos-tag SDS-PAGEを用いたタンパク質リン酸化反応の解析
  • 著者名/発表者名: 木下恵美子，木下英司，小池 透
  • 学会等名: 第10回日本プロテオーム学会大会
  • 発表場所: 東京科学未来館
• [図書] Phos-tag affinity electrophoresis for protein kinase profiling. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, E. Koike, T.
  • 総ページ数: 22
  • 出版者: Springer
• [図書] 臨床プロテオミクス～バイオマーカー探索から個別化医療へ (2012)
  • 著者名/発表者名: 木下英司, 木下恵美子，小池透
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: 金原出版
• [図書] DNA Replication and Mutation (2012)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, E. Koike, T.
  • 総ページ数: 21
  • 出版者: Nova Science Publishers
• [備考] 広島大学大学院医歯薬保健学研究院医薬分子機能科学研究室
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/tkoike/index.html