| 研究課題/領域番号 |
24H00403
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(A)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
中区分28:ナノマイクロ科学およびその関連分野
|
|---|
| 研究機関 | 名古屋大学 |
|---|
研究代表者 |
馬場 嘉信 名古屋大学, 未来社会創造機構, 特任教授 (30183916)
|
|---|
| 研究分担者 |
森 大 名古屋大学, 未来社会創造機構, 特任講師 (00588981)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2027-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2025年度)
|
| 配分額 *注記 |
48,100千円 (直接経費: 37,000千円、間接経費: 11,100千円)
2025年度: 15,340千円 (直接経費: 11,800千円、間接経費: 3,540千円)
2024年度: 17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
|
|---|
| キーワード | セルロースナノファイバ / 細胞外小胞 / がん / microRNA / 膜タンパク質 / セルロースナノファイバー / miRNA / プロテオミクス / LC-MS |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
近年、生体組織を構成する細胞から分泌される細胞外小胞が様々な疾患や生命現象と関連することが報告されている。本研究では、申請者らが開発した専用のセルロースナノファイバシートを利用して組織表面にある細胞外小胞を魚拓の要領で回収した後、分割したシート内のmicroRNAと膜タンパク質の発現量を解析する。この方法で得られる発現分子情報と位置情報を統合することで、組織表面の細胞外小胞プロファイリングを実現し、新たな視点による疾患メカニズムの解明に応用する。
|
| 研究実績の概要 |
本研究では「病理組織表面の細胞外小胞（EV）プロファイリング」の実現のため、独自開発したセルロースナノファイバー（CNF）シートの毛細管現象を利用して組織表面に分泌されているEVを回収し、グリッド状に分割したシート内に含まれる生体分子（microRNA、タンパク質）を解析する。2024年度はこれまでの知見を参考に基盤技術開発を進めた。
microRNA解析に関しては、1cm四方のCNFシート内のEV成分を解析する手法はすでに確立していたが、前処理法の最適化により、0.03～1 cm四方のCNFシート内のEVから解析することにも成功し、空間分解能がより高く鮮明なEVプロファイルリングが実現できる環境構築に成功した。
タンパク質解析に関しては、培養細胞EV標品（0.05～5ug）を吸着させた1cm四方のCNFシートをLC-MSで解析するための前処理法を検討した。結果として、①CNFシート断片をリン酸緩衝生理食塩水内に10分間浸透してEVを遊離、②1200xg・20分間の遠心後にEVを含む上清のみ回収（EV以外の固形物を除去）、③市販の精製キットでEVまたはエクソソームの洗浄（血液由来タンパク質などの除去）、④回収した試料に界面活性剤（n-Dodecyl-β-D-maltoside）を添加して超音波処理（タンパク質抽出）、⑤SP3法で磁性ビーズ表面に凝集させたタンパク質を洗浄・消化する方法（LC-MS用前処理）、というフローを確立した。
|
| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
3: やや遅れている
理由
タンパク質解析に関して、EV標品を使用した前処理法フローは構築したが、市販キットによるEV精製のプロトコル最適化や実試料（生体試料から回収したEV試料）によるフロー検証に着手できていない。
|
| 今後の研究の推進方策 |
組織を用いる解析については、民間受託機関を利用してマウス・ラット等の動物実験に着手するとともに、今後の臨床検体の入手に向けて共同研究先の確保に努める。miRNA解析に関しては実試料が入手できしだい先行して解析を進め、組織表面EVプロファイリングのデータを蓄積しながら解析意義の高い検体の選別を進める。タンパク質解析に関してはプロトコルの検討の継続、入手した実試料での検証を進める。また、LC-MSデータを補完するため、ウェスタンブロットやアプタマーを利用する解析（SomaScan）など別手法についても検討する。
|
