| 研究課題/領域番号 |
24K02613
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57020:病態系口腔科学関連
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
豊澤 悟 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (30243249)
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| 研究分担者 |
阿部 真土 大阪大学, 大学院歯学研究科, 講師 (40448105)
吉村 信一郎 大阪大学, 大学院医学系研究科, 講師 (60584521)
廣瀬 勝俊 大阪大学, 大学院歯学研究科, 助教 (00824898)
鵜澤 成一 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (30345285)
松井 崇浩 大阪大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (50747037)
佐藤 淳 大阪大学, 大学院歯学研究科, 講師 (70335660)
宇佐美 悠 大阪大学, 大学院歯学研究科, 講師 (80444579)
大家 香織 大阪大学, 歯学部附属病院, 助教 (00779126)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円)
2026年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2025年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2024年度: 7,930千円 (直接経費: 6,100千円、間接経費: 1,830千円)
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| キーワード | 線維性骨異形成症 / GNAS変異 / 体細胞モザイク / ファージディスプレイ法 / GNAS変異特異抗体 / 空間トランスクリプトーム / 空間トランスクリプトーム解析解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
線維性骨異形成症(FD)は、未熟骨を伴った線維組織が骨髄内に増生する骨疾患で、骨格変形や骨折を引き起こす。基本治療は外科的摘出であるが、多発例では外科処置の適応外となり、内科的治療の開発が望まれる。FDの原因はGNAS遺伝子の体細胞変異であり、シグナル伝達異常が起こって骨格系幹細胞の異常分化と増殖を引き起こす。また、FDはGNAS遺伝子変異細胞と野生型細胞が混在した体細胞モザイクであり、両細胞間相互作用はFDの病態に重要と考えられる。そこで、FDのモデルマウスとヒト病理組織を用いて、両細胞間相互作用を解析してFD病態を解明し、病態責任因子を同定してそれらを標的とした創薬を開発する。
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| 研究実績の概要 |
線維性骨異形成症(FD)は、骨格系幹細胞（skeletal stem cell：SSC）に起こったGNAS変異によるシグナル伝達異常により、SSCの異常な分化と増殖が起こる骨髄内発生の骨疾患である。FDはGNAS変異細胞と野生型細胞が混在した体細胞モザイクで、GNAS変異細胞の生存には野生型細胞と共存する必要があるという細胞移植実験から、両細胞間相互作用はFD病態に重要と考えられる。そこで、FDモデルマウスやヒトFD病理組織を用いて、空間トランスクリプトーム解析等による両細胞間相互作用の解明を目的として実験を行っている。
FD病変組織中のGNAS変異細胞を免疫組織化学的染色にて可視化・同定できるGNAS変異特異抗体作製のため、GNAS変異の翻訳産物であるGsα変異体(R201H)の組み換え蛋白質をHis-TagとAvi-Tagを付けて大腸菌にて作製した。His-Tag を用いて、Ni-NTAアフィニティー精製し、尿素で変性後、再度、Ni-NTAアフィニティー精製し、コンタミ産物を除去した。その後、組み換え蛋白質を再構成して、Avi-Tagによりビオチン化されたGsα変異体をストレプトアビジンアガロースビーズでプルダウンさせてGsα変異体を確認した。次に、Gsαが結合するGTPとGDPとの結合を検討したところ、Gsα変異体はGDPよりもGTPに結合能が高いことが分かり、生体内でのGsα変異体の特徴を再現できた。
また、病変組織の空間トランスクリプトーム解析では、解析過程で高温処理による硬組織切片のスライド硝子からの剥離が問題となるが、硬組織に適した最適なスライド硝子について検討を行った。そのスライド硝子を用いて、体細胞モザイクであるヒトFDとその関連骨疾患の空間トランスクリプトーム解析を行い病変の硬組織切片が剥離することなく遺伝子解析の生データを得た。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
GNAS変異特異抗体作製のため、GNAS変異の翻訳産物であるGsα変異体(R201H)の組み換え蛋白質の作製では大腸菌からの溶出条件設定に時間を要した。また、Ni-NTAアフィニティー精製ではコンタミ産物の除去が困難で、尿素にて変性後、再度、Ni-NTAアフィニティー精製し、コンタミ産物を除去した。その後、組み換え蛋白質を再構成して、Avi-Tagによりビオチン化されたGsα変異体をストレプトアビジンアガロースビーズでプルダウンさせてGsα変異体を確認できたが、コンタミ除去の過程でも時間を要したが、Gsα変異体(R201H)の組み換え蛋白質作製の課題点でもあり、計画時に想定されていた範囲内である。
病変組織の空間トランスクリプトーム解析の方は、解析過程で高温処理による硬組織切片がスライド硝子から剥離するのを防ぐため、様々な最適なスライド硝子を病変切片の高温処理実験で検討する時間を要したが、計画範囲内である。
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| 今後の研究の推進方策 |
得られたGsα変異体の組換え蛋白質を抗原として、野生型Gsαを認識せず、Gsα変異体を特異的に認識するGNAS変異特異抗体の作製を試みる。抗体作製には特異抗体を得る可能性の最も高いファージディスプレイ法を用いて抗体ファージ・ライブラリーを作製する。野生型Gsαとその変異体を区別できる抗体クローン候補を、ELISA実験系とFDモデルマウスとヒトFD病変の組織切片の免疫組織化学的染色によりスクリーニングするが、最も困難な実験過程であるため、時間を要することが予測される。
また、FDとその関連骨疾患の空間トランスクリプトーム解析の方は、得られた遺伝子解析データを分析し、FDのモザイク病態の特異性を検討する。
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