| 研究課題/領域番号 |
24K02653
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57070:成長および発育系歯学関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
谷本 幸太郎 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (20322240)
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| 研究分担者 |
國松 亮 広島大学, 医系科学研究科(歯), 准教授 (40580915)
加藤 功一 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (50283875)
廣瀬 尚人 広島大学, 病院(歯), 講師 (50611935)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)
2026年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2025年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2024年度: 9,750千円 (直接経費: 7,500千円、間接経費: 2,250千円)
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| キーワード | 再生医療 / エクソソーム / 乳歯歯髄幹細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、SHED由来のエクソソーム(CD146+SHED-Ex)は、特異的なインテグリン発現様式を呈するのか、組織再生に必要な特定の細胞を認識し作用することにより再生機序に関与するのか、骨再生治療に応用可能かを明らかにすることを目的とする。そのために、培養細胞実験および動物実験を行う。
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| 研究実績の概要 |
最初に、MSCs-Ex回収のために、ヒトSHEDを単離培養する。サンプル数はn=6を目標とした。便宜抜歯を行った乳歯を5名の患者から回収し、SHEDの単離培養を試行した。結果4サンプルの培養に成功し、十分に増殖したタイミングでセルバンカーにより凍結保存した。MSCsマーカーはCD73陽性、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34、CD陰性となった。SHEDよりmaxiPURE-EVsを用いてMSCs-Exを精製した。Micro BCA Protein Assayを用いたタンパク定量とFAPR-1000（DLS法）を用いた粒径分析を行い目的とする粒径(100nm~200nm前後)が含まれる分画を回収した。また、またクライオ電子顕微鏡観察から、100nm前後の小胞が回収できており、その他の大きさの粒子が認められないことが分かった。次に、ウエスタンブロット解析を用いてMSCs-Exの表面抗原を調べ、SHED由来Exの特徴を調べた。回収したMSCs-Exを含む液体と試料緩衝液を用いてウエスタンブロット用サンプルを調整し、ExマーカーであるCD9,CD63,CD81およびインテグリンa2, a3, av a6, b1, b 3, b 4, b 5,の有無を調べた。各抗原に対して、適した泳動様ゲルと転写時間の条件を調査中である。CD9, CD81, インテグリンb5, インテグリンa2, インテグリンavの陽性を確認できた。インテグリンのαサブユニットとβサブユニットの二量体の組み合わせは現在24種類知られているが、α2と組み合わせが成立するのはβ1のみである。したがってα2は存在しないか、またはβ1の条件に調整の余地があると考えられる。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
2024年度は、 実験1として各種MSCs由来エクソソーム（MSCs-Ex）のインテグリン発現を検討することとした。そのために、1)ヒトSHED, DPSCs, BMSCsの単離・培養 とCD146+/-SHEDのセルソーティング、2) MSCs-Exの精製と内包するmiRNAの解析、3)プロテオミクス解析(質量分析およびウエスタンブロット解析)を行うこととした。
ヒトSHEDの単離・培養と細胞表面マーカー（CD73, CD90, CD105）のウエスタンブロット解析による品質検査が行われた。また、MSCs-Exの回収については、粒径アナライザーで粒子径の計測と分布を確認するとともに、BCAアッセイを用いて定量を行った。さらに、クライオ電子顕微鏡を用いてMSCs-Exを撮影し、分離精製が適切に行われていることが確認された。さらに、MSCs-Ex表面マーカーであるCD9, CD63, CD81の発現をウエスタンブロット解析で検討し、MSCs-Exであることを確認した。また、MSCs-Exにおけるインテグリンの発現パターンをウエスタンブロットにて解析した。以上の進捗状況から、研究計画はおおむね順調に進んでいると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度(2025年度)においては、MSCs-Exの細胞への作用の検討を行う。そのためには、インテグリンの発現状況を正確に確認できることが前提条件となる。そこで、MSCs-Exにおけるインテグリンの発現状況については、各抗体の至適条件の調整を引き続き行う。さらに、由来（乳歯歯髄： SHED, 永久歯歯髄DPSCs, 骨髄BMSCs）の異なる各MSCs-Exにおけるインテグリンの発現特性の相違を比較検討する。
次に、骨再生に関連する細胞へのMSCs-Ex作用を検討する。骨欠損部周辺におけるMSCs-Exのターゲットとなる主要な細胞として、骨芽細胞、破骨細胞、血管内皮細胞が挙げられる 。それぞれの培養細胞における各種の取り込みを比較検討する。1) MSCs-Exのヒト骨芽細胞、ヒト破骨前駆細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞 、ヒトBMSCsへの取り込みの検討(in vitro) 、2) MSCs-Exの細胞への作用の定量PCRおよびウエスタンブロット法による検討(in vitro) を行う。
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