| 研究課題/領域番号 |
24K08481
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分34020:分析化学関連
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| 研究機関 | 九州工業大学 |
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研究代表者 |
末田 慎二 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (00325581)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2026年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2025年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2024年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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| キーワード | ATP検出 / 細胞外ATP / 蛍光検出 / 蛍光イメージング / ビオチン化酵素反応 / 細胞表層 / 酵素反応 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、細胞から放出されたアデノシン三リン酸（ATP）を細胞表層において高精度に検出することが可能な技術の開発を行う。ATPは細胞内において様々な反応のエネルギー源となる物質であるが、そのATPは細胞外においてシグナル伝達物質として機能することが近年明らかとなってきた。このような細胞外シグナル伝達物質としてのATPの機能をより詳細に解明するには、細胞から放出されたATPを細胞表層において高精度に検出する技術が不可欠である。そこで、本研究では、反応にATPを必要とする特殊な酵素反応系を利用して、細胞から放出されたATPを高い時間分解能・空間分解能で検出する技術の開発を行う。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、古細菌Sulfolobus tokodaii由来のビオチン化酵素反応系を利用して、細胞表層でアデノシン三リン酸（ATP）を検出する技術を開発することを目的としている。ビオチン化酵素反応にはATPが必須であり、またS. tokodaii由来の同酵素反応では、酵素であるビオチンリガーゼ（BPL）がその反応生成物であるビオチン化された基質タンパク質（BCCP）と安定な複合体を形成することがわかっている。そこで細胞表層にBPLを固定化し、蛍光ラベル化したBCCPを添加し、細胞表層でのBPLとBCCP間の複合体形成をモニターすることによってATPを検知する系の開発を目指している。
今年度はまず均一溶液中でのアッセイ系を利用して、BPLとBCCP間の複合体形成に基づいてATP検出が可能であることを示すデータを取得した。その後、BPLと膜タンパク質の融合体の発現系の構築を行った。ここでは膜タンパク質としてテイルアンカー型の膜タンパク質であるEmerinを利用した。具体的にはEmerinの膜貫通ドメイン（TM）を利用し、そのN末端とC末端にmRuby（赤色蛍光タンパク質）とBPLを連結した融合タンパク質（mRuby-TM-BPL）の発現プラスミドを作製した。その発現プラスミドを培養細胞（HeLa細胞及びHEK293細胞）に導入したところ、期待通り目的の融合タンパク質が発現し、さらに効率良く形質膜に移行することが確認できた。その後、蛍光ラベル化したBCCPを調製し、それをmRuby-TM-BPLを発現させた細胞に添加する実験を行った。その結果、ATPを共存させた条件下で、細胞表層からラベル化BCCPに由来する蛍光が観察され、期待通りビオチン化反応を介して、BCCPを細胞表層で捕捉できることが確認できた。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
ビオチンリガーゼを膜タンパク質との融合体として発現させることにより細胞表層に提示することに成功し、さらに蛍光ラベル化したBCCPを細胞表層で捕捉することに成功したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
作製に成功した融合タンパク質の発現系を利用して、様々な条件下でラベル化BCCPの捕捉実験を行い、ATP検出系としての評価を行う。ここでは様々な濃度のATPを添加してどの程度の検出感度があるのかについて評価を行う。またATP添加後の経時変化をモニターし、ATP検出に必要な反応時間についても評価する。さらにADPやAMPなどのATP類似体を添加した実験を行い、ATPに対する選択性を評価する。一方で、ATPを添加しない条件下でもラベル化BCCPが結合することが想定されるため、そのバックグラウンドレベルを評価し、シグナル/バックグラウンド比が最適となるような測定条件を検討する。最適な測定条件を検討した後に、実際に細胞から放出されるATPの検出を試みる。ここでは融合タンパク質を発現させた細胞に対して刺激を与え、その際放出されるATPをモニターする。まずは低浸透圧条件でATPが放出されることがわかっているため、培養液のイオン強度を低下させて、ATPが細胞から放出されることを確認する。次に生理活性物質（Thrombin等）を添加した際のATP放出挙動を詳細に検討する。それらの生理活性物質の添加に伴い、どのようなタイミングでどの程度の量のATPが放出されるかを詳細に検討する。
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