| 研究課題/領域番号 |
24K08824
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38060:応用分子細胞生物学関連
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| 研究機関 | 東京科学大学 |
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研究代表者 |
稲本 進 東京科学大学, 生命理工学院, 研究員 (90211747)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2026年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2025年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2024年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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| キーワード | ユビキチン化 / DNAメチル化 / エピジェネティクス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
DNAメチル化酵素DNMT3Aは、哺乳類のゲノムDNAのシトシンをメチル化して、エピジェネティクな情報を生成する重要な酵素である。本研究は、1)新たに発見した DNMT3Aがもつ「蛋白質をユビキチン化する活性」の制御機構を解明し、2) この活性の生理的意義を明らかにすることを目的とする。更に、3) DNMT3AによるDNAのメチル化と、ユビキチン化標的蛋白質が関与する新規パスウェイの発見を目指す。これにより (1)「エフェクター蛋白質上の修飾は、そこに結合する酵素の活性を制御する」という蛋白質の修飾の新たな機能と、(2) de novo DNAメチル化の新たな機能の提唱につながると期待される。
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| 研究実績の概要 |
DNAメチル化酵素DNMT3Aは、哺乳類のゲノムDNAのシトシンをメチル化することで、エピジェネティクな情報を生成するために必要な重要な酵素であるが、研究代表者により新たに、DNMT3Aが「蛋白質をユビキチン化する活性」を持つことが発見された。本研究は、1) DNMT3Aがもつ「蛋白質をユビキチン化する活性」の制御機構を解明し、2) この活性の生理的意義を明らかにすることを目的とした。更に、3) DNMT3AによるDNAのメチル化と、ユビキチン化標的蛋白質が関与する新たなパスウェイの発見を目指した。
(1) DNMT3A中のADDドメインはユビキチンリガーゼ活性（蛋白質をユビキチン化する活性）を持つ。一般にユビキチンリガーゼはユビキチン結合酵素（E2酵素）と結合し、E2酵素に共有結合しているユビキチンを基質蛋白質に受け渡す仲介役を果たす。そこで、リガーゼ反応で活性を示したE2酵素とADDドメインの結合を試験管内結合実験で調べたところ、結合が観察できなかった。他のユビキチンリガーゼにおいてもE2との結合を試験管内結合実験で観察したという報告がほとんどないので、1) E2とADDの結合は不安定で、短時間しか結合していないか、2) 使ったE2酵素はユビキチンが共有結合していないためであると考えられた。そこでAlphaFoldを用いADDドメインとE2酵素の構造予測を行い、結合を調べたところ、幾つかの水素結合で結合していることが予測された。
(2) マウスDnmt3aのリコンビナント蛋白質を用いて試験菅内ユビキチン化反応を行ったところ、Dnmt3aが自己ユビキチン化したと思われる分子が観察された。このことより全長のDnmt3aにおいてもユビキチンリガーゼ活性があることが示唆された。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
3: やや遅れている
理由
今回の研究期間中に、実験に使用していた精製蛋白質を保存していた超低温フリーザーが故障したため、蛋白質が失活してしまった。予算の都合上、所属している研究室で新しい超低温フリーザーの購入ができたのは3月になってからだったので、予定していた生化学的実験が遅れてしまった。蛋白質の再精製ができない間は、AlphaFoldなどを使い、in silicoでDNMT3AのADDドメインとユビキチン結合酵素（E2酵素）の結合に重要と考えられるアミノ酸残基の解析などを行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
DNMT3Aがもつ2つの酵素活性の関連を明らかにする為には、一方の酵素活性のみを持つ変異体が必要であるが、既にDNAメチラーゼの変異体作られている。これに対し、リガーゼ活性を持つADDドメインは、ヒストンH3の結合依存的にDNAメチラーゼ活性を活性化する、という機能も持つ。そのため「H3に結合してDNAメチラーゼを活性化できるが、ユビキチンリガーゼ活性は消失している」変異体を作成し、メチラーゼ活性とリガーゼ活性を分離して解析出来る様にする。そのために、令和6年度にin silicoで同定した、DNMT3AのADDドメインとE2酵素の結合に重要と予想されたアミノ酸残基を中心に変異体を作成し、リガーゼ活性のみを消失したDNMT3Aを作成する。さらに、全長のDNMT3A蛋白質を用い、ユビキチンリガーゼ活性の制御を調べる。また基質としてヌクレオソームを用いたユビキチン化反応を行い、ヒストンが基質である可能性を調べる。
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