| 研究課題/領域番号 |
24K09728
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47010:薬系化学および創薬科学関連
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
傳田 将也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 助教 (00813891)
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| 研究分担者 |
大高 章 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (20201973)
吉川 治孝 徳島大学, 先端酵素学研究所, 助教 (60709567)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2026年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2025年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | クロスリンク質量分析法 / タンパク質間相互作用解析 / クロスリンカー / aryl-tetrazole / プロテオミクス / ペプチド化学 / プロテオミクス解析 / タンパク質間相互作用 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
クロスリンク質量分析法は、細胞内での網羅的なタンパク質間相互作用解析および構造既知の複合体形成タンパク質間のトポロジー解析に不可欠な技術である。ここでは特定残基間を架橋する試薬（クロスリンカー）が必須であるが、既存試薬はリジン（Lys）側鎖アミノ基架橋型のみである。これは高いLys選択性を長所とする一方、残基架橋情報がLys-Lys間に限定される。さらに、活性エステルを利用するため、安定性の観点から細胞内適応は制限される。そこで本研究では、Lys以外を対象とする、安定かつオンデマンドな活性化が可能なクロスリンカーを開発し、当該リンカーによるタンパク質間トポロジー解析への展開可能性を検証する。
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| 研究実績の概要 |
細胞内での網羅的なタンパク質間相互作用（PPI）解析法の一つに、クロスリンク質量分析（XL-MS）法がある。本法は、近接アミノ酸残基間にクロスリンカーを用い架橋を構築し、架橋残基間の質量分析情報から網羅的なPPI解析を可能とするのみならず、多数の一定距離間にある架橋残基情報が得られるため、構造既知のPPI構成タンパク質間のトポロジー解析法としても不可欠な技術である。さて、XL-MS法では「クロスリンカー」が重要な役割を担う。これは、アミノ酸残基と反応する「反応部位」、架橋フラグメントの濃縮を担う「濃縮部位」、質量分析データ解析を容易にする「切断部位」からなるが、本研究はクロスリンカー「反応部位」の問題点に焦点を絞り展開する。実用化された既存リンカーは、リジン（Lys）側鎖アミノ基架橋型リンカーのみである。これは高いLys選択性を長所とする一方、架橋情報がLys-Lys間に限定されることが問題点である。さらに、反応部位は、恒常的活性型のN-ヒドロキシスクシイミド（NHS）エステルが利用されており、易加水分解性とオンデマンドな活性化が不可能という問題がある。そこで「光照射をトリガーに活性化後、タンパク質側鎖カルボン酸と選択的に反応し、安定な架橋を形成するクロスリンカー」を開発することとした。令和6年度は、光活性化型カルボン酸反応基「aryl-tetrazole（ATZ）」ユニットを利用した、クロスリンカー開発に取り組み、合成を達成するとともに、当該クロスリンカーの溶解性などの物性について検証を行った。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
当該年度、研究代表者は、カルボン酸含有アミノ酸架橋を可能とする「aryl-tetrazole（ATZ）」ユニット導入型クロスリンカーの開発と相互作用タンパク質間のトポロジー解析への展開可能性を検証に向け、ATZユニット導入型クロスリンカーの合成を行った。合成法としては、これまでに報告あるLys架橋型NHSクロスリンカーを合成後、NHS部分に対して1級アミンを有するATZユニットを反応させて合成する計画である。そこでまず、当該年度は、Lys架橋型NHSクロスリンカーの合成を行い、検討に用いる十分量の合成を達成した。続いて、ATZユニットの合成を行った。市販の原料から6工程で一級アミノ基を有するATZユニットへ誘導した。本研究では、ATZユニットを2個および1個有するATZユニット導入型クロスリンカーを合成し、それらクロスリンカーを用いて相互作用タンパク質間をクロスリンクすることで、相互作用情報を取得する計画であるが、まずは合成の簡便さからATZユニットを2つ有するATZユニット導入型クロスリンカーの合成を行った。検討の結果、クロスリンク検討に用いるための十分量のATZユニット導入型クロスリンカーの合成を達成したため、続いて本クロスリンカーの溶解性の検討を実施した。溶解性検討の結果、ジメチルスルフィドには問題なく溶解することを確認した。そこで続いてクロスリンク検討に用いる緩衝液に対する溶解度に関する検討を行い、クロスリンク検討の最適条件探索を実施した。以上よりおおむね順調に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
当該年度は、ATZユニットを二つ有するATZユニット導入型クロスリンカーの合成および当該クロスリンカーを用いたクロスリンク条件の最適化を達成している。そこで、今後は本クロスリンカーを用いて、モデルペプチド中でのクロスリンク効率の算出を実施後、モデルタンパク質であるアルブミンのクロスリンク検討を実施し、本ATZユニット導入型クロスリンカーの有用性を評価する。続いて、ATZユニットを一つ有するATZユニット導入型クロスリンカーの合成表を確立し、ATZ-ATZクロスリンカーとATZ-NHSクロスリンカーを用いたクロスリンクでクロスリンク情報に違いがあるかを検証する計画である。
またこれまでのATZユニット導入型クロスリンカーの溶解度に関する検討から、緩衝液への溶解性について検討する必要があることが示唆されている。そこで、必要な場合にはATZユニット導入型クロスリンカーのATZユニットの構造最適を実施し、より水溶性が高い構造のATZユニット導入型クロスリンカーを開発する。
これらの検討を実施後、実際に相互作用するタンパク質であるMycおよびMaxを用いてクロスリンク検討を実施し、クロスリンク情報から相互作用情報が取得可能か検討を行う。さらに、ATZユニットをホモおよびヘテロで有するATZユニット導入型クロスリンカーを用いたクロスリンク情報に違いがあるか検討を行い、本ATZユニット導入型クロスリンカーの有用性を検証し、新たなクロスリンカーを開発する計画である。
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