細胞質シャペロニンのアセンブリー機構解明に向けた検討

研究課題

研究課題/領域番号	24K23191
研究種目	研究活動スタート支援
配分区分	基金
審査区分	0701:分子レベルから細胞レベルの生物学およびその関連分野
研究機関	九州大学
研究代表者	八木田悠一九州大学, 基幹教育院, 助教 (10709174)
研究期間 (年度)	2024-07-31 – 2026-03-31
研究課題ステータス	交付 (2024年度)
配分額 *注記	2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円) 2025年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円) 2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
キーワード	細胞質シャペロニン / タンパク質複合体 / アセンブリー因子 / タンパク質複合体形成
研究開始時の研究の概要	細胞質シャペロニン（CCT）は、タンパク質のフォールディングを補助する分子シャペロンで、8つのサブユニットからなるリングが2つ積み重なった構造をとる。CCTが正常な機能を発揮するためには、サブユニットが正しく集合（アセンブリー）する必要があるが、その機構は発見から約30年が経過した現在もほとんど未解明である。本研究では、CCTのアセンブリー過程が特異的なタンパク質分子によって仲介される可能性について検討する。
研究実績の概要	本課題研究では、細胞質シャペロニン（CCT）専用のアセンブリー因子が存在する可能性について検討する。CCTは8つの異なるサブユニットから成るリングが2つ積み重なった構造を持つ。2つのリングは同一で、リング内のサブユニットの並びは決まっている。CCTサブユニットはパラログであり、複数のサブユニットと相互作用する可能性、ひいてはサブユニットの並びが非標準的なCCT様の集合体を形成する可能性を秘めている。しかし、通常、細胞内では非標準的集合体は見られない。このことは、正確で効率的なアセンブリーを促進するアセンブリー因子や非標準的な集合体の蓄積を防ぐ品質管理因子の存在を想起させる。本年度は、まず、CCTアセンブリー因子候補の同定を試みた。既存のプロテオミクスデータを用いてCCTサブユニットの相互作用因子を探索し、各因子について、既知情報の精査、AlphaFoldを用いた相互作用予測などを行い、アセンブリー因子候補として2つのタンパク質を選定した（ここではcCAF1とcCAF2と呼ぶ）。ヒト培養細胞にCCTサブユニットを発現させ、免疫沈降を行ったところ、プロテオミクスデータから予想されるサブユニットと内在性cCAF1あるいはcCAF2との間に相互作用が確認された。続いて、タグ付きCCTサブユニットをcCAF1ノックダウン細胞に発現させ、その挙動をNative PAGEにて解析した。その結果、コントロール細胞と比較して、CCT複合体（に相当するサイズ）のバンドの減少が観察され、cCAF1がCCTアセンブリー因子として働く可能性が示唆された。また、将来的に内在性CCTサブユニットのアセンブリーを解析するために、アッセイ系の構築にも着手した。
現在までの達成度	現在までの達成度 2: おおむね順調に進展している理由既存の情報とAlphaFoldによる構造・相互作用予測を活用することで、CCTアセンブリー因子候補として2つのタンパク質を同定し、両因子とCCTサブユニットとの相互作用を実験的に確認することができた。また、候補因子の一つであるcCAF1のCCTアセンブリーへの寄与を示唆するデータも得られている。しかしながら、これは外来性CCTサブユニットを用いた解析の結果であり、内在性CCTサブユニットの挙動解析などを通じてより確かな証拠を積み上げる必要があると考えている。なお、本年度途中より、米国のグループと共同研究を開始した。同グループによる解析の結果、cCAF1の出芽酵母ホモログもまたCCTアセンブリーに寄与することが示唆されている。さらに、哺乳動物系と出芽酵母系を用いて得られたデータやそれに基づき実施した構造予測の結果などから、cCAF1の作用機序についても作業仮説を構築するに至っている。一方、もう一つのアセンブリー因子候補cCAF2については、CCTアセンブリーへの寄与を試験できておらず、今後の課題と言える。
今後の研究の推進方策	外来性のタグ付きCCTサブユニットを用いた解析から、cCAF1がCCTアセンブリーに寄与することが示唆された。しかし、現時点では、外来性のタグ付きサブユニットが標準的なCCT複合体を形成するという確証が得られていないため、確固たる証拠とは言い難く、内在性タンパク質の挙動解析などを通じてさらなる検証が必要と考えている。今後は、内在性CCTサブユニットのアセンブリーを観察できる実験系を確立し、cCAF1発現抑制の影響を解析する計画である。また、cCAF2についても同様にCCTアセンブリーに寄与する可能性を検討する。さらに、cCAF1の作用機序に関して、哺乳動物系と出芽酵母系における情報を集約することですでに作業仮説を構築できているため、その検証作業を進めていく。共同研究を進める中で、CCTやCCTアセンブリー因子候補に関して、哺乳動物系と出芽酵母系で多くの共通点がある一方、相違点があることも明らかになってきた。共通点や相違点に関する情報は、CCTアセンブリー機構について考察する際はもちろん、実験系構築の場面などにおいても有益なため、今後の研究に最大限活用していく。哺乳動物系を用いた研究と出芽酵母系を用いた研究で相互補完しながら本課題研究を推進する。