| 研究課題/領域番号 |
24KJ1692
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分44010:細胞生物学関連
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
花井 悠真 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-23 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2025年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2024年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
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| キーワード | ゲノム編集 / ノックイン / 非相同末端結合 / イントロン / イントロン読み枠 / CRISPRノックインスクリーニング / ハイコンテントスクリーニング / ストレス顆粒 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞内生体高分子は液－液相分離を介して、特定の環境下で膜を持たない多様な液滴を形成する。相分離制御が破綻すると、細胞毒性を呈す凝集化へと導き、神経変性疾患発症の一因となるため、凝集化までの遷移過程を明らかにすることは重要である。特に近年では、液滴組成の不均一性が凝集化の一因として重要視されているにも拘わらず、液滴組成の変化を網羅的に解析することは、労働集約的な工程が多く難しい。そこで本研究では、CRISPRノックインスクリーニング手法により、液滴組成の不均一性や時空間情報を簡便に体系化することで、凝集化しやすい細胞質液滴組成を同定することを目指す。
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| 研究実績の概要 |
本年度は、CRISPRノックインスクリーニング系を用いて凝集化しやすい細胞質液滴組成を同定する系の確立のために、HEK293T細胞において細胞質液滴を形成することがタンパク質相互作用解析により同定されている候補遺伝子を対象としたノックイン細胞ライブラリ作製を行った。その結果、116ノックイン細胞 (計87遺伝子)と当初の予定よりも多くのノックイン細胞を作製することができ、ノックイン細胞が発現する各融合タンパク質の細胞内局在やタンパク質発現を観察することができた。加えて、イントロン非相同末端結合 (NHEJ)ノックイン法で得られた実験データ (425イントロン領域に対するフローサイトメトリーデータ、116ノックイン細胞の融合タンパク質の細胞内局在、69ノックイン細胞のタンパク質発現)を容易に調べることができるデータベースを公開することができた。ノックイン細胞を量産化する上で必要なゲノムワイドの情報リソースに関しては、ヒトやマウスにおける (イントロン読み枠、イントロンgRNA配列、AlphaFoldを用いたイントロン周辺のタンパク質立体構造情報)の整備を行い、ノックイン実験に有用なデータベース The Knock-In Atlas (https://yumahanaiatokamuralab.shinyapps.io/KnockInAtlas/)を公開することができた。上記のデータベースを用いることで、実験設計に必要な時間コストを最小限にすることができている。以上より、ノックイン細胞を大規模に作製するために必要な情報リソースを整備することができた。加えて、これらの一連の成果をプレプリントとしてまとめることができた (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.02.19.638564v1)。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本年度は、CRISPRノックインスクリーンング系確立のためのノックイン細胞ライブラリを、当初の計画していた以上に整備することができた。加えて、ライブラリ樹立過程で得られた中規模程度の実験データやノックイン細胞を量産化する上で必要なゲノムワイドの情報リソースをまとめたデータベース The Knock-In Atlasを公開することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度は、当初の予定通り、作製したノックイン細胞ライブラリに対して種々のストレス誘導系を用いたCRISPRノックインスクリーニング手法により、液滴組成の不均一性や時空間情報を解析するとともに、凝集化しやすい細胞質液滴組成を見出すことを目指す。凝集化等の物理学的特性の解析に加え、既知の細胞質液滴マーカーと共局在しない非典的細胞質液滴にも着目し、そのライブセルイメージングや液滴移動性を追跡することで液滴特性を解析する。
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