無細胞翻訳系を用いた膜タンパク質進化分子工学的手法の開発と応用

• 研究課題/領域番号: 25282239
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 一部基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: ケミカルバイオロジー
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 松浦 友亮 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50362653)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 18,850千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 4,350千円); 2015年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円); 2014年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円); 2013年度: 12,350千円 (直接経費: 9,500千円、間接経費: 2,850千円)
• キーワード: 進化分子工学 / 無細胞翻訳系 / 膜タンパク質 / リポソーム / 膜蛋白質

研究成果の概要

本研究では、in vitroで膜タンパク質をスクリーニング可能な技術であるリポソームディスプレイ法を確立し、これを利用した膜タンパク質の機能進化を行うことを目的とした。大腸菌由来の多剤排出トランスポーターEmrEをモデル膜タンパク質として用い、これの２つの機能である輸送活性と膜挿入活性を指標に機能進化が行える技術を確立した。次にランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーから野生型EmrEよりも基質輸送活性の高い遺伝子プールを取得した。また、リポソームディスプレイ法に膜タンパク質輸送装置であるトランスロコンを導入することで、ディスプレイ可能な膜タンパク質のレパートリーの拡張に成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Liposome-based in vitro evolution of aminoacyl-tRNA synthetase for enhanced pyrrolysine derivative incorporation. (2015)
  • 著者名/発表者名: Uyeda A, Watanabe T, Kato Y, Watanabe H, Yomo T, Hohsaka T, Matsuura T
  • 雑誌名: Chembiochem 巻: 16 号: 12 ページ: 1797-1802
  • DOI: 10.1002/cbic.201500174
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] <i>In vitro</i> directed evolution of alpha-hemolysin by liposome display (2015)
  • 著者名/発表者名: Fujii, S., Matsuura, T., and Yomo, T.
  • 雑誌名: BIOPHYSICS 巻: 11 号: 0 ページ: 67-72
  • DOI: 10.2142/biophysics.11.67
  • NAID: 130004940815
  • ISSN: 1349-2942
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] MembranCurvature Affects the Formation of alpha-Hemolysin Nanopores (2015)
  • 著者名/発表者名: Fujii, S., Matsuura, T., and Yomo, T.
  • 雑誌名: ACS Chem Biol. 巻: 未定 号: 7 ページ: 1694-701
  • DOI: 10.1021/acschembio.5b00107
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of ribosomes on the kinetics of Qb replication (2014)
  • 著者名/発表者名: Usui, K., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Matsuura, T., Yomo, T
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 588 号: 1 ページ: 117-123
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.11.018
  • 査読あり
• [雑誌論文] The evolutionary enhancement of genotype-phenotype linkages in the presence of multiple copies of genetic material (2014)
  • 著者名/発表者名: Uno, K., Sunami, T., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Matsuura, T., and Yomo, T.
  • 雑誌名: Chembiochem 巻: 15 号: 15 ページ: 2291-2288
  • DOI: 10.1002/cbic.201402299
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of giant unilamellar vesicles with permeability to small charged molecules (2014)
  • 著者名/発表者名: Nishimura, K., Matsuura, T., Sunami, T., Fujii, S., Nishimura, K., Suzuki, H., and Yomo, T.
  • 雑誌名: Rsc Adv 巻: 4(66) 号: 66 ページ: 35224-35232
  • DOI: 10.1039/c4ra05332j
  • 査読あり
• [雑誌論文] Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system (2014)
  • 著者名/発表者名: Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., and Yomo, T.
  • 雑誌名: J Biosci Bioeng 巻: 118 号: 5 ページ: 1578-1591
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2014.04.019
  • NAID: 110009894841
  • 査読あり
• [雑誌論文] Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins (2014)
  • 著者名/発表者名: Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., and Yomo, T.
  • 雑誌名: Nat Protoc 巻: 9 号: 7 ページ: 1578-1591
  • DOI: 10.1038/nprot.2014.107
  • 査読あり
• [雑誌論文] In Vitro Membrane Protein Synthesis Inside Cell-Sized Vesicles Reveals the Dependence of Membrane Protein Integration on Vesicle Volume. (2013)
  • 著者名/発表者名: Soga, H., Fujii, S., Yomo, T., Kato, Y., Watanabe, H. and Matsuura, T.
  • 雑誌名: ACS synthetic biology 巻: 0 号: 6 ページ: 372-379
  • DOI: 10.1021/sb400094c
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cell-free Protein Synthesis in a Microchamber Revealed the Presence of an Optimum Compartment Volume for High-order Reactions (2013)
  • 著者名/発表者名: T. Okano, T. Matsuura, H. Suzuki, and T. Yomo
  • 雑誌名: ACS Synthetic Biology 巻: 3 号: 6 ページ: 347-352
  • DOI: 10.1021/sb400087e
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Kinetic model of double-stranded RNA formation during long RNA replication by Qβreplicase (2013)
  • 著者名/発表者名: Usui, K., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Matsuura, T., Yomo, T
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 587 号: 16 ページ: 2565-2571
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.06.033
  • 査読あり
• [雑誌論文] Darwinian evolution in a translation-coupled RNA replication system within a cell-like compartment (2013)
  • 著者名/発表者名: Ichihashi, N., Usui, K., Kazuta, Y., Sunami, T., Matsuura T., Yomo, T
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 4 号: 1 ページ: 1-7
  • DOI: 10.1038/ncomms3494
  • NAID: 120006831817
  • 査読あり
• [学会発表] 無細胞タンパク質合成系を用いた膜タンパク質進化分子工学 (2016)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: 第4回 ネオバイオ分子研究会
  • 発表場所: 大阪府立大学I-site なんば・大阪市
  • 年月日: 2016-01-29
  • 招待講演
• [学会発表] バイオ界面を利用したin vitro進化分子工学 (2015)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: 日本生物工学会第67回大会
  • 発表場所: 城山観光ホテル・鹿児島市
  • 年月日: 2015-10-26
  • 招待講演
• [学会発表] 無細胞タンパク質合成系を用いた膜タンパク質進化分子工学 (2015)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール, 徳島市
  • 年月日: 2015-06-24
  • 招待講演
• [学会発表] In Vitro Selection and Evolution of Membrane Proteins” Gordon Research Conferences in Proteins (2015)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Matsuura
  • 学会等名: Gordon Research Conferences in Proteins
  • 発表場所: Boston, U.S.A.
  • 年月日: 2015-06-15
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] in vitroで生体分子を使って組み上げる生命システム. (2014)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: 国際高等研研究プロジェクト「分子基盤に基づく生体機能ネットワークとダイナミクスの解明」第1回研究会プログラム
  • 発表場所: 国際高等研研究（木津川市）
  • 年月日: 2014-12-14 – 2014-12-15
  • 招待講演
• [学会発表] IN VITRO EVOLUTION OF alpha-HEMOLYSIN USING A LIPOSOME DISPLAY (2014)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Matsuura
  • 学会等名: Protein Society Meeting
  • 発表場所: SanDiego, U. S. A.
  • 年月日: 2014-07-27 – 2014-07-30
  • 招待講演
• [学会発表] Engineering Membrane Proteins Entirely in vitro with Liposome Display Technology (2014)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Matsuura
  • 学会等名: KSBB SPRING MEETING and INTERNATIONAL SYMPOSIUM
  • 発表場所: Hyundai Hotel, Gyeongju, Korea
  • 年月日: 2014-04-10
  • 招待講演
• [学会発表] 無細胞系を用いたタンパク質エンジニアリングの新技術 (2014)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: 2013年度日本生物工学会技術セミナー
  • 発表場所: 神戸大学瀧川記念学術交流会館
  • 招待講演
• [学会発表] In vitro evolution and selection of membrane proteins with liposome display technology (2014)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: Korea-Japan Smart Biodesign Workshop: Technology exchange for green biotechnology
  • 発表場所: Aobayama Memorial Hall, Tohoku University
  • 招待講演
• [学会発表] Chemistry of “Origins of life” (2014)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: JFFos Symposium
  • 発表場所: Metz,France
  • 招待講演
• [学会発表] In vitro evolution of alpha-hemolysin using a liposome display (2013)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: 第22回酵素工学国際会議
  • 発表場所: 富山国際会議場
• [学会発表] タンパク質合成反応シミュレーターの構築 (2013)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: 第8回無細胞生命科学研究会
  • 発表場所: 新潟大学
• [学会発表] リポソーム内部合成膜タンパク質はベシクルサイズ依存的に膜挿入される (2013)
  • 著者名/発表者名: 曽我遥 加藤泰彦 渡邉肇 松浦友亮
  • 学会等名: 第8回無細胞生命科学研究会
  • 発表場所: 新潟大学
• [学会発表] リポソーム内無細胞膜タンパク質合成系ヘのトランスロコンの導入 (2013)
  • 著者名/発表者名: 太田直樹 渡邉肇 松浦友亮
  • 学会等名: 第8回無細胞生命科学研究会
  • 発表場所: 新潟大学
• [学会発表] 無細胞タンパク質合成系を用いた構成的アプローチ (2013)
  • 著者名/発表者名: 松浦友亮
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸国際会議場
  • 招待講演
• [備考] 渡邉研ホームページ
  • URL: http://www.bio.eng.osaka-u.ac.jp/ez/project/system.html
• [産業財産権] 改良型α-ヘモリシンおよひそれを用いたナノポアシーケンサ (2013)
  • 発明者名: 四方哲也、松浦友亮、數田恭章、藤井聡志
  • 権利者名: 四方哲也、松浦友亮、數田恭章、藤井聡志
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2013-157799
  • 出願年月日: 2013-10-10