改良型二次元インゲルホスファターゼアッセイの確立とホスファターゼ研究の新展開

• 研究課題/領域番号: 25350978
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: ケミカルバイオロジー
• 研究機関: 香川大学
• 研究代表者: 亀下 勇 香川大学, 農学部, 教授 (60127941)
• 研究分担者: 末吉 紀行 香川大学, 農学部, 准教授 (90346635)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円); 2015年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2014年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2013年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
• キーワード: 細胞内情報伝達 / タンパク質リン酸化 / プロテインホスファターゼ / カルモジュリンキナーゼ / 翻訳後修飾 / プロテインキナーゼカスケード / タンパク質リン酸化反応 / 活性制御機構 / ツーハイブリッドスクリーニング / 活性制御因子 / 二次元電気泳動 / インゲルアッセイ / 酸化還元 / 蛍光発生基質

研究成果の概要

本研究では、以下の２つの課題：（１）ユニークな二次元インゲルホスファターゼアッセイ法の確立とその応用、ならびに（２）CaMキナーゼホスファターゼ（CaMKP）を始めとしてPPMファミリーホスファターゼの活性制御メカニズムの解明、を中心にして研究を進めた。まず、蛍光発生基質を用いた新しい二次元インゲルホスファターゼアッセイ法を確立し、実用化までこぎつけることができた。また、これまではCaMKPと核局在型のCaMKP-Nに関して、細胞内での活性制御機構や局在変化について不明の点が多かったが、本研究課題を通してこれらのホスファターゼの活性制御機構に関する多くの知見を得ることができた。

研究成果

• [雑誌論文] Expression analyses of splice variants of zebrafish cyclin-dependent kinase-like 5 and its substrate, amphiphysin 1 (2016)
  • 著者名/発表者名: Syouichi Katayama, Yukako Senga, Ami Oi, Yosuke Miki, Yasunori Sugiyama, Noriyuki Sueyoshi, Isamu Kameshita
  • 雑誌名: Gene 巻: 583 号: 1 ページ: 15-23
  • DOI: 10.1016/j.gene.2016.02.036
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Critical Determinants of Substrate Recognition by Cyclin-Dependent Kinase-like 5 (CDKL5) (2015)
  • 著者名/発表者名: Syouichi Katayama, Noriyuki Sueyoshi and Isamu Kameshita
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: in press 号: 19 ページ: 2975-2987
  • DOI: 10.1021/bi501308k
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The phosphatase-resistant isoform of CaMKI, Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Iδ (CaMKIδ), remains in its 'Primed' form without Ca2+-stimulation. (2015)
  • 著者名/発表者名: Senga Y, Ishida A, Shigeri Y, Kameshita I, Sueyoshi N.
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 54 号: 23 ページ: 3617-3630
  • DOI: 10.1021/bi5012139
  • 査読あり
• [雑誌論文] Regulation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase phosphatase (CaMKP/PPM1F) by protocadherin-gamma C5 (Pcdh-gamma C5) (2015)
  • 著者名/発表者名: Onouchi T, Kishino-Kaneko Y, Kameshita I, Ishida A, Sueyoshi N.
  • 雑誌名: Arch Biochem Biophys 巻: 585 ページ: 109-120
  • DOI: 10.1016/j.abb.2015.09.014
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations (2015)
  • 著者名/発表者名: Naohiro Kon, Yasunori Sugiyama, Hikari Yoshitane, Isamu Kameshita, Yoshitaka Fukada
  • 雑誌名: Communicative & Integrative Biology 巻: 8 号: 4 ページ: 1-4
  • DOI: 10.4161/19420889.2014.982405
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Expression and phosphorylation state analysis of intracellular protein kinases using Multi-PK antibody and Phos-tag SDS-PAGE (2015)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama, Y., Katayama, S., Kameshita, I., Morisawa, K. Higuchi, T., Todaka, J., Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Koike, T., Taniguchi, T., Sakamoto, S.
  • 雑誌名: MethodsX 巻: 2 ページ: 469-474
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of calmodulin on expressionof lignin-modifyingenzymes in Pleurotus ostreatus (2014)
  • 著者名/発表者名: Suetomi, T., Sakamoto, T., Tokunaga, Y., Kameyama, T.,Honda, Y., Kamitsuji, H., Kameshita, I., Izumitsu, K., Suzuki, K., Irie, T.
  • 雑誌名: Curr. Genet. 巻: 14 号: 2 ページ: 1-14
  • DOI: 10.1007/s00294-014-0460-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] TandeMBP: Generation of a unique protein substrate for protein kinase assays. (2014)
  • 著者名/発表者名: (1)Kameshita, I., Yamashita, S., Katayama, S., Senga, Y., Sueyoshi, N.
  • 雑誌名: J. Biochem. 巻: 156 号: 3 ページ: 147-154
  • DOI: 10.1093/jb/mvu025
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Cellular localization of CoPK12, a Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase in mushroom Coprinopsis cinerea, is regulated by N-myristoylation and limited proteolysis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kaneko K, Tabuchi M, Sueyoshi N, Ishida A, Utsumi T, Kameshita I
  • 雑誌名: Journal of Biochemistry 巻: in press 号: 1 ページ: 51-61
  • DOI: 10.1093/jb/mvu018
  • 査読あり
• [雑誌論文] CaMKII is essential for the cellular clock and coupling between morning and evening behavioral rhythms. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kon N, Yoshikawa T, Honma S, Yamagata Y, Yoshitane H, Shimizu K, Sugiyama Y, Hara C, Kameshita I, Honma K, Fukada Y.
  • 雑誌名: Genes Dev 巻: 28 号: 10 ページ: 1101-1110
  • DOI: 10.1101/gad.237511.114
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 液相等電点泳動を用いた二次元泳動法の活用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉山康憲、片山将一、馬場裕美、末吉紀行、亀下勇
  • 雑誌名: 生物物理化学 巻: 58 号: 2 ページ: 56-58
  • DOI: 10.2198/sbk.58.56
  • NAID: 130004704687
  • ISSN: 0031-9082, 1349-9785
  • 査読あり
• [雑誌論文] インゲルキナーゼアッセイ法～その後の進歩 (2014)
  • 著者名/発表者名: 石田敦彦、亀下勇
  • 雑誌名: 生物物理化学 巻: 58 号: 2 ページ: 62-64
  • DOI: 10.2198/sbk.58.62
  • NAID: 130004704689
  • ISSN: 0031-9082, 1349-9785
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nuclear translocation of doublecortin-like protein kinase and phosphorylation of a transcription factor JDP2 (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Nagamine, S. Nomada, T. Onouchi, I. Kameshita, N. Sueyoshi
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 446 号: 1 ページ: 73-78
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.02.075
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of amphiphysin 1 as an endogenous substrate for CDKL5, a protein kinase associated with X-linked neurodevelopmental disorder. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sekiguchi M, Katayama S, Hatano N, Shigeri Y, Sueyoshi N, Kameshita I.
  • 雑誌名: Archives of Biochemistry and Biophysics 巻: 535(2) 号: 2 ページ: 257-267
  • DOI: 10.1016/j.abb.2013.04.012
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ink-native electrophoresis: An alternative to blue-native electrophoresis more suitable for in-gel detection of enzymatic activity. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kaneko K, Sueyoshi N, Kameshita I, Ishida A,
  • 雑誌名: Anal. Biochem. 巻: 440 号: 2 ページ: 142-144
  • DOI: 10.1016/j.ab.2013.05.026
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression and gene knockdown of zebrafish Ca/calmodulin-dependent protein kinase I-LL (2013)
  • 著者名/発表者名: Y. Senga, K .Yoshioka, I. Kameshita, N. Sueyoshi
  • 雑誌名: Arch. Biochem. Biophys. 巻: 540 ページ: 41-52
  • 査読あり
• [雑誌論文] An active C-terminally truncated form of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase phosphatase-N (CaMKP-N/PPM1E). (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishida A, Tsumura K, Oue M, Takenaka Y, Shigeri Y, Goshima N, Ishihara Y, Hirano T, Baba H, Sueyoshi N, Kameshita I, Yamazaki T.
  • 雑誌名: BioMed Res. Int. 巻: 2013 ページ: 134813-134813
  • DOI: 10.1155/2013/134813
  • NAID: 120006557539
  • 査読あり
• [学会発表] 抗がん剤を処理したヒト白血病細胞HL-60の細胞内キナーゼの発現およびリン酸化動態の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 杉山康憲、片山将一、亀下勇、森澤啓子、樋口琢磨、戸高寛、木下英司、木下恵美子、小池透、坂本修士
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-04
• [学会発表] 担子菌Coprinopsis cinereaの成長菌糸に存在するCaMキナーゼ（CoPK02）の性質 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山下雅史、片山将一、千賀由佳子、杉山康憲、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-03
• [学会発表] Amphiphysin 1のCLAP領域はCyclin-dependent kinase-like 5によってリン酸化されるために重要である (2015)
  • 著者名/発表者名: 片山将一、大井愛海、三木洋祐、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-03
• [学会発表] Protocadherin gamma subfamily C5 (Pcdh-C5)によるCaMK phosphatase (CaMKP-N/PPM1E) の分解抑制 (2015)
  • 著者名/発表者名: 小野内貴士、石田敦彦、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-03
• [学会発表] CaMキナーゼホスファターゼはニューロフィラメントLと結合して重合を阻害する (2015)
  • 著者名/発表者名: 尾崎華、加藤剛志、中川綾子、石原康宏、末吉紀行、亀下勇、谷口隆信、山崎岳、石田敦彦
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-02
• [学会発表] Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A (DYRK1A)によるCyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5) のリン酸化とその意義 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大井愛海、片山将一、三木洋祐、波多野直哉、杉山康憲、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] Ca2+/CaM-dependent protein kinase I（CaMKI）によるDistal-less homeobox 1 (Dlx1)のリン酸化とオステオカルシンの転写制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 秋月一駿、千賀由佳子、杉山康憲、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] CaMKIとCaMKIのホスファターゼ抵抗性に注目した活性調節機構の比較解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 千賀由佳子、石田敦彦、茂里康、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 第88回日本生化学会・第38回日本分子生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] マルチPK抗体とPhos-tagを利用した細胞内リン酸化動態の新規解析法 (2015)
  • 著者名/発表者名: 杉山康憲、亀下勇、坂本修士
  • 学会等名: 第66回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-10-19
• [学会発表] カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIアイソフォーム（CaMKIαとCaMKIδ）の自己リン酸化に着目した比較解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 秋月一駿、千賀由佳子、杉山康憲、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 第56回日本生化学会 中国・四国支部例会
  • 発表場所: 松江市
  • 年月日: 2015-05-30
• [学会発表] Rett症候群の発症に関わるCyclin-dependent kinase-like 5（CDKL5）のアミノ酸変異と基質リン酸化活性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大井愛海、片山将一、杉山康憲、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 第56回日本生化学会 中国・四国支部例会
  • 発表場所: 松江市
  • 年月日: 2015-05-30
• [学会発表] CaMKIdeltaによるDistal-less homeobox 1 を介した骨形成メカニズム (2014)
  • 著者名/発表者名: 千賀由佳子、杉山康憲、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 日本分子生物学会年回
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-28
• [学会発表] ゼブラフィッシュに存在する２種類のCDKL5のスプライスバリアントの比較解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 片山将一、千賀由佳子、大井愛海、三木洋祐、杉山康憲、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-28
• [学会発表] プロトカドヘリンγC5を介したCaMKホスファターゼの制御メカニズム (2014)
  • 著者名/発表者名: 小野内貴士、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-28
• [学会発表] PPMホスファターゼは金属配位部位に隣接するCys残基の酸化還元によって活性制御を受ける (2014)
  • 著者名/発表者名: 馬場裕美、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-28
• [学会発表] Exploration of an endogenous substrate for DCKL5, a protein kinase associated with X-linked neurodevelopmental disorders (2014)
  • 著者名/発表者名: katayama, S., Sueyoshi, N., Kameshita, I.
  • 学会等名: 第15回IUBMB
  • 発表場所: 台北
  • 年月日: 2014-10-22 – 2014-10-24
• [学会発表] 大腸菌発現系を用いた高活性型CaMKP-Nの取得とその利用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 朝波彰、小野内貴士、馬場裕美、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 日本生化学会本会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] カルシウムがなくても潜在的活性化状態にあるホスファターゼ抵抗性CaMKIアイソフォーム (2014)
  • 著者名/発表者名: 千賀由佳子、石田敦彦、茂里康、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 日本生化学会本会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] 金属依存性プロテインホスファターゼPPM1Bの機能解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 樫村明理、渡辺真以、馬場裕美、小野内貴士、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 日本生化学会中四国支部例会
  • 発表場所: 愛媛
  • 年月日: 2014-06-05 – 2014-06-06
• [学会発表] Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼホスファターゼの機能解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小野内貴士、馬場裕美、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 日本生化学会中四国支部例会
  • 発表場所: 愛媛
  • 年月日: 2014-06-05 – 2014-06-06
• [学会発表] TandeMBP: MBPを超えるプロテインキナーゼ用人工基質の創製
  • 著者名/発表者名: 山下翔、片山将一、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 日本生化学会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] CDKL5によるAmphiphysin1のリン酸化とCDKL5の基質特異性の解析
  • 著者名/発表者名: 片山将一、関口茉里、三木洋祐、末吉紀行、亀下勇
  • 学会等名: 日本生化学会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] CaMKIδはCaMKIαとのN末端領域のアミノ酸の相違によりホスファターゼ抵抗性を有するようになる
  • 著者名/発表者名: 千賀由佳子、亀下勇、石田敦彦、末吉紀行
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸
• [学会発表] DCLKの核移行に伴うキナーゼ活性の制御メカニズム
  • 著者名/発表者名: 野間田祥悟、永峰賢、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸
• [学会発表] Pcdhgc5を介したCaMKP-Nの活性化メカニズム
  • 著者名/発表者名: 小野内貴士、亀下勇、末吉紀行
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸
• [学会発表] メタル依存性プロテインホスファターゼ（PPM)の酸化的修飾による活性制御
  • 著者名/発表者名: 馬場裕美、末吉紀行、渡辺真以、樫村明理、茂里康、五島直樹、亀下勇
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸
• [学会発表] CDKL5とCaMキナーゼIの新規基質タンパク質
  • 著者名/発表者名: 亀下勇
  • 学会等名: 蛋白研セミナー
  • 発表場所: 大阪大学
  • 招待講演
• [備考] 動物機能生化学研究室
  • URL: http://www.ag.kagawa-u.ac.jp/sueyoshi/index.html